一种新的快速简便的抗肿瘤药物筛选模型

本研究利用 DNA修复缺陷的大肠埃希氏菌 343/ 5 91和正常的大肠埃希氏菌 343/ 6 36的差异性DNA修复特性 ,建立了液体悬浮法和琼脂固体筛选方法 ,用于抗肿瘤药物的筛选。这两种方法简便易行 ,其中琼脂固体筛选方法与抗生素生物鉴定杯碟法一样简单 ,适合于大量筛选各种来源的抗肿瘤药物。

中国的抗生素研究和生产

对我国开发和生产的各类抗生素，包括抗细菌、抗真菌、抗肿瘤抗生素及微生物产生的生理活性物质，及其在研究开发和生产中遇到的技术问题和解决方法作了简要综述。

产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析

产黄青霉原生质体制备过程中 ,菌丝体最佳酶解条件与原生质体释放最适条件不同 ,菌丝体培养基含有 0 .0 5 % L-天冬酰胺时 ,选取培养 48h的菌丝体 ,在裂解酶 (L ysing enzym e)浓度 15 mg/ ml,0 .7mol/ LKCl作为渗透压稳定剂的条件下酶解 ,可获得大量原生质体 ;同时 ,再生培养基中含有 2 5 mm ol/ L Ca2 +离子、上层琼脂浓度 1.1% 。

利用根瘤农杆菌LBA4404 Ti质粒介导高效转化产黄青霉及克隆vgb基因

通过根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) L BA4 4 0 4中 Ti-质粒的介导将含有透明颤菌血红蛋白 (Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)基因 vgb和博来霉素 (bleomycin)抗性基因转移到产黄青霉 (Penicilliumchrysogenum)中 ;利用根瘤农杆菌介导转化产黄青霉孢子时需要有乙酰丁香酮诱导 ;转化菌丝体时乙酰丁香酮不是必要的 ,但一定浓度的乙酰丁香酮可提高转化率 ,与原生质体转化法相比可提高转化率 10倍左右。

柔红霉素产生菌阻断突变株的筛选和鉴别

经NTG和紫外光诱变,从天蓝淡红链霉菌正定变种SIPI 1482中获得了阻断突变株N-18和U-25,通过TLC和HPLC分析,证明这两突变株的主要产物均为ε—紫红霉酮,这表明它们都在生物合成途径的中间步骤被阻断。

质粒pIJ702转化天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌种的条件研究

天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２是一株蒽环类抗生素柔红霉素的产生菌。在建立该菌种基因工程研究所需的载体宿主系统的研究中，发现从变青链霉菌分离的质粒ｐＩＪ７０２不能直接转化ＳＩＰＩ１４８２菌种。经排除ＳＩＰＩ１４８２菌种自身内含质粒，试验了热休克衰减ＤＮＡ酶活性、不同时间培养的菌丝体制备的原生质体、ＰＥＧ１０００的浓度以及硫涟丝菌素选择时间等因素对ｐＩＪ７０２转化ＳＩＨＩ１４８２菌种的影响，证实上述绪因素都不是决定是ｐＩＪ７０２转化ＳＩＰＩ１４８２菌种成败的主要原因。采用ＳＩＰＩ１４８２菌种的阻断突变株Ｎ－１８为中介宿主菌，最终获得了质粒ｐＩＪ７０２转化ＳＩＰＩ１４８２菌种的成功。从Ｎ－１８转化子分离的质粒ｐＩＪ７０２再转化Ｎ－１８和亲株ＳＩＰＩ１４８２，观察到转化频率的大幅度提高，这些结果表明ＳＩＰＩ菌株具有限制一修饰系统，采用突变株为中介宿主可能是克服质粒转化限制性障碍的一个有效方法。

三角代数上的中心化子

设T是三角代数,Ω是T中任意但固定的一点。证明线性映射Φ∶T→T对满足ST=Ω的S,T∈T有Φ(ST)=Φ(S)T=SΦ(T),当且仅当对任意的S,T∈T有Φ(ST)=Φ(S)T=SΦ(T),即Φ是中心化子。

产黄青霉vgb转化菌PTH-1嗜盐新特性研究

利用 Ca Cl2 /PEG介导的原生质体转化法获得一株有产抗能力的产黄青霉 vgb转化菌 PTH- 1。该转化菌具有嗜盐性 ,必须在含有高浓度 KCl的培养基中才能生长。在该盐条件下转化菌 PTH - 1对博莱霉素抗性稳定 ,具有摄氧率高、易自溶、细胞壁脆弱等特性。在高盐发酵试验中 ,PTH - 1产抗比对照株提高 14%。

天蓝淡红链霉菌SIPI 1482及其突变株的研究 Ⅱ.钠离子对突变株SIPI 1482-NS-4恢复合成柔红霉素的调节作用

:SIPI1482 - NS- 4是柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌 SIPI1482经紫外诱变获得的阻断突变株 ,没有合成柔红霉素的能力。但在 GM培养基中添加 2 % Na Cl后 ,该突变株的菌体生长量虽有所减少 ,却能恢复合成柔红霉素2 2 %～ 2 4% (以亲株为对照 )。研究还发现使突变株恢复合成柔红霉素起主要作用的是 Na+ ,而非高渗透压、Cl- 或整个 Na

头状链霉菌中丝裂霉素C抗性基因mcrAB的克隆及其作用研究

丝裂霉素 C属于苯醌类抗肿瘤抗生素 ,在生物体内作为前药 ,经酶催化还原后可阻碍 DNA的复制。我们从头状链霉菌中克隆出丝裂霉素 C抗性基因 mcr AB,测序结果与另一丝裂霉素产生菌—淡紫灰链霉菌的 mcr AB基因序列进行了比较 ,结果表明此序列是高度保守的。同时还构建了带有 mcr AB基因的质粒载体 p YG2 0 6 ,将 p YG2 0 6用原生质体转化法导入变青链霉菌 TK6 4 ,并在此菌中表达 ,大大提高了该菌对丝裂霉素 C的抗性。进一步研究表明 :在有氧条件下 ,mcr AB基因表达的蛋白可抑制菌体对丝裂霉素 C的转化作用。

天蓝淡红链霉菌SIPI 1482及其突变株的研究I.发酵过程中细胞结构的变化

用光学显微镜和透射电子显微镜 ,研究天蓝淡红链霉菌 SIPI1482及其突变株 SIPI1482 - NS- 4在发酵过程中细胞形态和超微结构的变化。发现两者最大的不同在于 :亲株能合成柔红霉素 ,产抗期细胞内含物丰富 ,但脂肪颗粒较少 ;突变株不能合成柔红霉素 ,细胞中含有丰富的脂肪颗粒。由于柔红霉素的生物合成与脂肪酸的合成密切相关 。

柔红霉素生物合成调节因子的初步研究

本实验研究发现，玉米粉中存在调节柔红霉素产生菌ＳＩＰＩ－１４８２生物合成柔红霉素的因子。这种调节因子的性质可能类似于已经报道的Ｂ因子，它不仅具有恢复突变株产生柔红霉素的能力，且能明显地提高亲株ＳＩＰＩ－１４８２和另一柔红霉素产生菌ＳＩＰＩ－ＰＦ－２５的生产能力。

柔红霉素和襄樊霉素产生菌突变生物合成的研究

从柔红霉素产生菌SIPI1482和襄樊霉素产生菌SIPI80334诱变获得了阻断突变株SIPI1482-NS-4和SIPI80334-U33。利用这两株突变株,以柔红霉酮和柔红霉素为底物,获得了13-S-双氢柔红霉酮、13-R-双氢柔红霉酮、13-双氢柔红霉素、N-乙酰-柔红霉素和N-乙酰-13-双氢柔红霉素等转化产物。并讨论了不同属蒽环类抗生素产生菌对不同底物的转化特性等。

Na^+调节天蓝淡红链霉菌突变株SIPI1482-NS-4合成柔红霉素的机制研究

SIPI 1482 - NS- 4是柔红霉素的产生菌天蓝淡红链霉菌 SIPI 1482的阻断突变株 ,不能合成柔红霉素。研究发现 Na+对 SIPI1482 - NS- 4恢复合成柔红霉素具有调节作用。在 GM培养基中添加 2 % Na Cl后 ,虽然突变株的菌体生长量降低 ,细胞脂肪含量下降 ,电镜还观察到细胞中脂肪颗粒显著减少 ,但不产抗生素的负突变株 SIPI 1482 - NS- 4却恢复合成柔红霉素 ,推测 Na+的这种调节作用可能同初级代谢与次级代谢之间的代谢流向有关。检测突变株 SIPI 1482 - NS- 4在 GM培养基和 GM+2 % Na Cl培养基中 ,催化柔红霉素前体丙酰 Co A合成的甲基丙二酰 Co A羧基转移酶 (MCT)和甲基丙二酰 Co A脱羧酶 (MDC)的活力变化 ,结果发现在 GM培养基中 MCT酶和 MDC酶的活力很低 ,但添加了 2 % Na Cl后 ,伴随着柔红霉素的恢复合成 ,MDC酶活力迅速提高。说明 SIPI 1482 - NS- 4的阻断突变与前体丙酰 Co A有关 ,Na+诱导了 MDC酶 ,从而前体丙酰 Co A重新合成 ,突变株恢复合成柔红霉素。亲株 SIPI 1482在 GM培养基中 ,MDC酶的活力很低 ,但 MCT酶的活力和柔红霉素的生物合成有一定的相关性 ;培养基添加 2 % Na Cl后 ,MDC酶的活力上升 ,柔红霉素产量提高。说明在 SIPI1482中 ,柔红霉素前体丙酰 Co A主要是通过 MCT酶途径催化而生成的 。

丝裂霉素C产生菌对自身产物转化作用的研究

丝裂霉素 C发酵液放罐后 ,放置一段时间 ,已合成的丝裂霉素 C便迅速被转化。研究表明丝裂霉素产生菌——头状链霉菌中存在有某种物质 ,在氧气减少的情况下可转化丝裂霉素。其转化反应有最适温度 (36°C左右 )和最适 p H值 (p H7左右 ) ,同底物作用的过程类似酶与底物的反应过程 ;这种物质对高温敏感 ,其反应亦可被蛋白质变性剂 SDS所抑制 。

天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌株graORF1同源基因的克隆

将含有ａｃｔⅢ基因的质粒ｐＩＪ２３４６及其带有ｇｒａＯＲＦ１～４质粒ｐＩＪ５２０５～５２０８作探针与天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２菌种的染色体ＤＮＡ杂交。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ显示ｐＩＪ２３４６能与２．１ｋｂ的ＢａｍＨⅠ片段杂交；ｇｒａＯＲＦ１能与约６．０ｋｂ和约１０ｋｂＢａｍＨⅠ以及约２０ｋｂＢｃｌⅠ片段杂交。除２．１ｋｂＢａｍＨⅠ片段外，其余的同源片段克隆到质粒ｐＵＣ１８形成几个克隆子，并经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ确认这些同源片段的存在。含有约１０ｋｂ同源ＤＮＡ片段的ｐＹＧ２５，当转化加利利链霉茵３１６１７时，发现能大大地促进该菌株色素的分泌，表明约１０ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段含有某种调节基因。当将质粒ｐＹＧ１１的约６ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段克隆到ｐＩＪ６８０构成杂合质粒ｐＹＧ２６并导入变青链霉菌ＴＫ６４，发现同源基因的导入能引起变青链霉菌ＴＫ６４表型的显著变化，表明约６ｋｂ同源基因编码了某些与分化有关的基因。

头孢菌素C发酵添加侧链的研究

如在头孢菌素C(简称CPC)的发酵培养基中,添加硫脲、头孢孟多侧链,1-甲基-5-巯基四唑等含硫化合物,发酵过程中在CPC累积的同时,可生成CPC 3位取代衍生物,其效价约占头孢菌素总效价的20～26%,且不影响CPC的产量和提取收率。这些副产物综合利用,有一定的经济意义。

马杜拉放线菌对柔红霉素转化的酶学研究

洋红霉素产生菌玫瑰紫马杜拉放线菌(Actinomadura roseoviolacea)对柔红霉素有很强的转化能力,而且其主要转化方式亦为糖苷键的还原裂解。针对这一现象,利用该菌种对催化柔红霉素糖苷键还原裂解反应的酶作了初步研究,并探讨柔红霉素发酵生产方面的应用。 一、玫瑰紫马杜拉放线菌对柔红霉素的无细胞转化及其产物的确定: 菌种在YMG_1培养基(葡萄糖0.4％,麦芽汁1％,酵母膏0.4％,pH6.0)中培养可获得不产洋红霉素的菌体,收集菌体在0.05mol/L pH7.