3种脂质体介导法转染大鼠小胶质细胞的比较研究

目的以LipofectamineTM2000为对照,研究GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ在大鼠小胶质细胞中的转染效率及毒性。方法分别采用LipofectamineTM2000、GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ为载体,转染绿色荧光蛋白(GFP)标记的siRNA进入大鼠小胶质细胞。计算转染效率。采用磺基罗丹明B法(SRB)分析转染试剂对细胞的毒性,并研究细胞传代次数、接种密度、脂质体与siRNA的比例及脂质体-siRNA复合物形成时间等对脂质体转染效率的影响。结果 2～3次细胞传代,接种密度为1×105(24孔板)、脂质体与siRNA比例为1∶2.5、脂质体-siRNA复合物形成时间分别为30 min或15 min,转染效率最高。3种不同脂质体介导的GFP-siRNA转染的大鼠小胶质细胞内均有GFP表达,其最佳转染比例下转染效率比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01);3种转染剂的细胞毒性比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01)。结论阳离子脂质体GenEscortTMⅠ比LipofectamineTM2000细胞毒性低,转染效率可,是一种更为理想的小胶质细胞基因转染载体。

脑源性神经生长因子促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的探索脑源性神经生长因子(BDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用。方法应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含β-巯基乙醇(BME)、BDNF及碱性成纤维细胞因子(bFGF)的条件培养基使培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定。结果分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs的形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论BMSCs在体外具有分化为神经元样细胞的能力,BDNF具有促进分化的作用。

在荷瘤裸小鼠体内研究抗癌药物筛选流程

为了寻找抗癌新药,全世界已筛选了约60万种有关物质,被推荐到临床使用的亦有数百种之多,但对人体癌瘤治疗确实有效的尚不足50种。筛选成功率小于万分之一,说明筛选工作有“大海捞针”之难度,故要求我们从速改进现有的筛选体系与方法。

人骨髓基质细胞向神经细胞分化的方法学研究

目的改进采用人骨髓体外培养人骨髓基质细胞(hBMSCs),进行体外传代扩增,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法.方法抽取人骨髓血,淋巴细胞分离液分离,DMEM/15%人血清培养传代,至第3～5代时加入巯基乙醇(BME),观察hBMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化.结果该方法hBMSCs在体外可以实现数目扩增,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化.结论采用少量骨髓样本,既可培养获得充足的细胞量,可以满足定向诱导和细胞移植的需要.

雷公藤单体体外抑制胶质瘤细胞的实验研究

背景与目的:已有研究发现雷公藤具有抗肿瘤作用,本研究旨在探讨雷公藤单体对胶质瘤细胞的体外抑制作用。方法:通过MTT法测定3种雷公藤单体(甲素、红素和WilforolA)对胶质瘤细胞株SHG44、C6、U25的体外抑制作用;应用免疫组化法观察雷公藤甲素与雷公藤红素对SHG44胶质瘤细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:雷公藤二萜类单体雷公藤甲素对胶质瘤细胞有极显著的抑制作用;雷公藤三萜类单体中红素的抑制作用次之。两者均使SHG44细胞Bax表达增加,Bcl-2表达下降。结论:雷公藤甲素与雷公藤红素对胶质瘤细胞有明显的抗肿瘤作用,其作用与促进Bax表达、抑制Bcl-2表达、导致细胞凋亡有关。

雷公藤红素抑制血管内皮细胞株增殖的体外研究

目的探讨雷公藤红素抑制血管内皮细胞体外增殖的机理。方法通过生长曲线、HE染色以及流式细胞仪分析雷公藤红素抑制血管内皮细胞株ECV304体外增殖状况。结果在体外雷公藤红素能够明显抑制内皮细胞株ECV304增殖,低浓度(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的雷公藤红素主要引起血管内皮细胞S期受阻,高浓度(20μg/ml)同时还表现为细胞毒作用,引起血管内皮细胞坏死。结论雷公藤红素通过阻碍DNA合成及细胞毒作用抑制血管内皮细胞的体外增殖。

骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2的表达及可能机制

目的研究骨癌痛大鼠脊髓背角钾离子-氯离子联合转运体2(potassium-chloride cotransporter2,KCC2)的表达变化及其可能机制。方法采用大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立胫骨癌痛模型。观测种瘤前后大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawl thresthold,MWT)和脊髓背角KCC2表达水平的变化,观察痛敏形成前鞘内预注射酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine protein kinase B,TrkB)中和抗体阻断脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BD-NF)-TrkB途径对KCC2表达和机械性痛觉超敏的影响。结果大鼠种瘤后6～12d,MWT明显下降(P<0.01),出现明显的机械性痛敏,脊髓背角KCC2蛋白水平进行性降低(P<0.01);鞘内预注射TrkB中和抗体的骨癌痛大鼠,其脊髓KCC2表达水平和MWT明显高于注射IgG和不作处理的骨癌痛大鼠(P<0.01)。结论脊髓背角的KCC2可能参与了骨癌痛的发生发展,而BDNF-TrkB途径可能介导了该作用。

针对小胶质细胞上BDNF表达的siRNA筛选及其抑制效应检测

目的筛选有效抑制小胶质细胞上脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,并观察其对小胶质细胞活性标记物OX-42表达的调节作用。方法设计并合成针对BDNF的siRNA3对(siRNA1588,siRNA283,siR-NA232)及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。分别采用Real-TimePCR及Western blot方法测定并比较其抑制率;采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)分析转染复合物的细胞毒性。同时采用免疫荧光组织化学结合共聚焦显微镜观察BDNF和OX-42的表达情况。结果①与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比,BDNFsiRNA1588(50μmol·L-1,脂质体与siRNA比例1∶3)干扰小胶质细胞后,其mR-NA和蛋白的相对表达量最低(P<0.01)。②Lipofectami-neTM 20008μl复合50μmol·L-1siRNA(脂质体与siRNA比例为1∶3),不仅细胞毒性低而且转染效率高(P<0.01),为最佳转染条件。③BNDF和OX-42存在共表达;且siR-NA1588作用后OX-42的平均光密度值(IOD/area)明显降低(P<0.01)。结论①siRNA1588对小胶质细胞上BDNF表达的抑制效果最大。②BDNF在小胶质细胞的活性调节中具有重要作用。

替莫唑胺诱导的人脑胶质瘤耐药细胞系的建立及其耐药性逆转

目的 建立对替莫唑胺（temozolomide,TMZ）耐药的胶质瘤细胞系并探讨其逆转方式。方法 通过体外分步诱导法使人脑胶质瘤U251细胞对TMZ产生耐药性;利用细胞集落形成实验检测U251/TR的耐药指数;采用MTT法检测O^6-BG对TMZ的细胞毒反转效应。结果 历经6个月建立了对TMZ耐药的U251/TR,在0.25-16μg/mlTMZ培养液中,其细胞形成相对率是未诱导组U251细胞的4-11倍;U251/TR对TMZ的耐药指数约为4;MGMT抑制剂O^6-BG可明显增加TMZ对耐药系的细胞毒作用。结论 通过分步诱导法在体外建立了一株对TMZ耐药的细胞系,其耐药性可被O^6-BG成功地逆转成药敏细胞。

大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛

目的观察脊髓趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,或CCL2)在骨癌痛大鼠中的可能作用。方法大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立骨癌痛模型。观测造模前、后大鼠机械性痛觉超敏Von Frey阈值并观察造模后d 10～12,鞘内给予MCP-1中和抗体对大鼠Von Frey阈值和脊髓小胶质细胞激活标志物(ox-42)表达的影响。结果大鼠种瘤后6～12 d,机械性痛觉超敏Von Frey阈值进行性下降(P<0.01);与对照组相比,鞘内给予MCP-1中和抗体后,脊髓ox-42的表达水平明显降低(P<0.01),Von Frey阈值的明显升高(P<0.01)。结论大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛,其机制可能与抑制小胶质细胞的激活相关。

^3H—TdR参入裸鼠移植瘤作为抗癌药物筛选方法的初步研究

将~3H-TdR参入裸鼠移植瘤内,用液体闪烁计数技术测量其中氚的含量。结果表明:不同的市售抗癌药无论对可移植性人脑胶质瘤还是对患者手术标本移植在裸小鼠皮下的肿瘤都有不同的抑制~3H-TdR参入作用。初步提示,此法可用于筛选抗癌药物。

重症胸部创伤大鼠Th1/Th2平衡变化的实验研究

目的检测重症胸部创伤大鼠受伤后7 d外周血单个核细胞(PBMC)培养上清液γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)水平,研究其Th1、Th2细胞功能的动态变化。方法雄性SD大鼠20只随机分为对照组与创伤组,创伤组大鼠进行胸部撞击建立重症胸部创伤模型,对照组进行假撞击。分别于受伤前及受伤后第1、3、5、7天取全血各1.0 m l,分离PBMC体外培养72 h,收集上清液冻存,ELISA法集中检测IFNγ-、IL-4浓度。结果两组大鼠伤后IFN-γ、IL-4水平均迅速升高,但创伤组IFN-γ水平低于对照组,而IL-4水平高于对照组。两组大鼠IFN-γ上升倍数/IL-4上升倍数(ΔIFN-γ/ΔIL-4)比值伤后均升高,创伤组在伤后第3天恢复1.0左右、并继续降低至0.34,对照组伤后7 d内始终高于1.0。结论轻度创伤可以诱导大鼠Th1细胞功能加强;重症创伤大鼠在伤后早期以Th1细胞功能增强为主,创伤急性期后随着Th2细胞功能持续增强、Th1细胞功能受到抑制,发生Th1细胞向Th2细胞的漂移。

腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗增强机体免疫功能的实验研究

目的 研究腺病毒介导的人 GM- CSF基因转染瘤苗体内抗肿瘤免疫作用极其机理。方法 应用 GM- CSF基因转染、辐照的瘤苗对小鼠肝癌模型进行免疫基因治疗 ,观察该疗法对荷瘤小鼠脾细胞 NK、L AK、CTL 活性的影响、脾淋巴细胞转化反应的影响以及荷瘤小鼠的生存期。结果 经 GM- CSF基因转染瘤苗治疗后 ,脾细胞 CTL活性显著升高 ,而 NK、L AK细胞活性未见明显增强、脾淋巴细胞转化反应显著增强、生存期显著延长。结论 GM- CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应 ,揭示了应用该疗法进行肿瘤基因治疗的可行性。

Dickkopf1在两株人脑胶质瘤细胞株中的表达

目的检测Dickkopf1(DKK1)在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中的表达情况。方法采用酶联免疫吸附实验,逆转录多聚酶链反应等方法对DKK1在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中表达水平进行检测。结果酶联免疫吸附实验提示DKK1在MGR3和UWR7中均呈高浓度;逆转录多聚酶链反应提示DKK1基因在胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中高表达,但在正常脑组织中表达不明显。结论 DKK1在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中高表达,提示DKK1可能在胶质瘤中的发生发展中起重要作用。

脑挫伤后糖和前列腺素代谢变化的实验研究

利用大鼠脑挫伤模型,研究脑挫伤后脑组织糖和前列腺素代谢的变化规律。实验结果提示脑挫伤后脑组织中葡萄糖、乳酸和TXB_2、6酮-PGF_(1α)含量均有增加,其中以乳酸和TXB_2最为显著。乳酸和TXB_2的升高是加剧脑挫伤后脑损害的重要因素之一,设法降低乳酸和TXB_2的含量将有助于减轻继发性脑损害。

胶质瘤患者血清VEGF、bFGF及uPA定量分析的临床价值

目的 探讨胶质瘤患者血清VEGF、bFGF及uPA水平与胶质瘤及其分级的关系。方法 采用酶联免疫吸附法(ELISA )定量分析 40例胶质瘤患者及 8例健康人血清VEGF、bFGF及uPA水平 ,并进行比较分析。结果 Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤患者血清VEGF、bFGF水平显著高于Ⅰ、Ⅱ级者和正常对照组 ;而胶质瘤患者血清uPA水平显著高于正常对照组 ,不同级别的胶质瘤其upA水平比较无显著性差异。 结论 级别高的胶质瘤患者血清中VEGF、bFGF及uPA水平均有显著性升高 ,三者可作为临床诊断胶质瘤的辅助指标。

胶质瘤组织中DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化研究

背景与目的:O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase,MGMT)是肿瘤细胞产生亚硝脲药物抗药性的分子基础。启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活,影响MGMT蛋白表达。本研究探索了胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态及其与MGMT蛋白表达的关系。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应分析胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态,同时采用免疫组织化学法分析胶质瘤组织中MGMT蛋白表达情况。结果:在27例胶质瘤患者的肿瘤组织标本中,18例MGMT蛋白表达呈阳性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为38.9%;9例MGMT蛋白表达呈阴性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为77.8%(P<0.05)。结论:MGMT基因启动子区的甲基化状态与MGMT蛋白的表达相关。MGMT基因启动子过甲基化,MGMT蛋白表达较低;MGMT基因启动子去甲基化,MGMT蛋白表达较高。

雷公藤红素体外抑制血管内皮细胞增殖的研究

恶性胶质瘤多具有丰富的间质血管,抗肿瘤血管形成是当前胶质瘤治疗研究的热点之一。本研究探讨雷公藤红素体外抑制血管内皮细胞增殖的机理。方法:通过生长曲线、细胞涂片、HE染色后光镜下观察、以及流式细胞仪研究雷公藤红素抑制血管内皮细胞株ECV304体外增殖的机理。结果:生长曲线表明,在体外雷公藤红素能够明显抑制内皮细胞株ECV304增殖。内皮细胞经流式细胞仪分析表明,低浓度时(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的雷公藤红素主要引起内皮细胞S期受阻,高浓度时(20μg/ml)同时还表现为细胞毒作用,引起内皮细胞坏死。结论:雷公藤红素通过阻碍DNA合成及细胞毒作用抑制内皮细胞的体外增殖。

脑胶质瘤组织中R132H突变型hIDH1基因双顺反子真核表达载体的构建及鉴定

目的以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDH1R132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体。方法以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5'末端引入3×Flag标签;通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3'末端引入3×Flag标签;通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架;转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定。结果 PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了hIDH1基因。结论成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1R132H/3×Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础。