应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。

伪狂犬病病毒TK、gE双基因缺失传代致弱株的安全性及免疫效力研究

为获得安全、有效的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株弱毒疫苗,在前期研究的基础上,对PRV变异株TK、gE双基因缺失株(PRV LA1206株)进行传代致弱,在鸡胚成纤维细胞上连续传代75次,后经连续5代挑取单个病毒蚀斑克隆而得F_(80)代,毒种命名为PRV LA1206-80株,并对其进行安全性及免疫效力评价。生长动力学试验结果显示,PRV LA1206-80株与PRV LA1206株生长动力学相似。仔猪安全性试验结果显示,滴鼻接种1日龄PRV抗体阴性仔猪后所有仔猪均未出现发热及临床症状,表明该毒株对1日龄仔猪安全。攻毒保护试验结果显示,28~35日龄仔猪肌肉注射接种PRV LA1206-80株或PRV LA1206株7 d后进行变异株PRV AH02LA株滴鼻攻毒,可产生良好保护,所有仔猪均未出现体温反应、临床症状和排毒。而PRV Bartha K61株免疫猪7 d后攻毒,均出现了体温反应,其中1头发病,且鼻拭子样品均检出病毒。综上所述,相较于PRV LA1206株,在鸡胚成纤维细胞上连续传代后获得的PRV LA1206-80株已进一步致弱,对1日龄PRV抗体阴性仔猪安全,且该PRV TK、gE双基因缺失传代致弱株对PRV变异株的保护效果显著优于PRV Bartha K61株,是极具应用价值的PRV弱毒疫苗候选株。

表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒的构建

为了应用和发展鸭肠炎病毒(DEV)载体疫苗,基于细菌人工染色体(BAC)人工合成带有p MCMV IE启动子和HA基因序列的表达盒,将其插入到UL55和LORF11之间的非编码区,从而构建出DEV载体疫苗。RFLP分析结果显示DEV BAC及其突变体条带与预期结果存在轻微的差异,将BAC及其突变体拯救后发现其生长性能与亲本病毒没有显著差异。间接免疫荧光和Western blot结果显示,载体疫苗在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后大量表达了HA蛋白质。表明成功构建了能稳定表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒。

一种应用LORF11同源子鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法

为建立一种鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法,根据已发表的8株鸭瘟病毒株的长区开放阅读框(LORF11)等位基因序列,在其开放阅读框等位基因的上游5 bp和下游101 bp的位置设计1对特异性引物。应用这对引物对鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株DNA进行PCR扩增,分别获得了4 448 bp、3 277bp、934 bp和2 518 bp的特异性条带。此PCR方法特异性强,敏感性高,可检测到10TCID50或0.1LD50的鸭瘟病毒。在感染鸭瘟病毒的组织(肝脏)中均能检测到鸭瘟病毒DNA。对疑似鸭瘟的临床病料的检测结果也证明,建立的PCR方法不仅能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒,而且能鉴别感染的鸭瘟病毒的来源。

猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC^(PRV-G)。提取BAC^(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC^(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA^(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。

猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28~35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28~35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178~1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28~35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。

猪细小病毒灭活疫苗NJ株毒种分离及鉴定

为防控猪细小病毒病,进行了猪细小病毒灭活疫苗毒种研究。将南京某猪场初产母猪流产胎儿的脾、肺等组织病料处理后接种ST细胞培养,获得了1株猪细小病毒强毒,将分离毒株适当稀释接种ST细胞,经3轮蚀斑纯化获得1株纯净的猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株),作为疫苗毒株。将NJ株接种ST细胞培养连续传15代,每代次病毒效价均不低于1 ml 107.25TCID50、血凝素效价不低于29。选择第5代病毒液,灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成灭活疫苗,以不同剂量分别免疫豚鼠和后备母猪,用血凝抑制试验(HI)和ELISA检测抗体效价。分别用剂量0.125 ml、0.250 ml和0.500 ml疫苗免疫豚鼠28 d后,各免疫组HI抗体效价均高于28,0.5 ml组HI抗体效价高达211,ELISA抗体均显示阳性(OD630≥0.32),分别用剂量0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml疫苗免疫后备母猪后,HI检测结果显示,3个剂量组免疫后1周HI抗体效价高于26,3周后达峰值,至免疫后4个月略有下降,2.00 ml剂量组HI效价最高(211.75)。ELISA检测结果显示,各剂量组在免疫后1周均转阳(OD630≥0.32),免疫后4～18周均维持较高水平。HI抗体效价和ELISA抗体水平与免疫剂量均呈正相关性。结果显示,利用NJ株病毒制备的灭活疫苗具有抗体产生快、效价高等特点,显示出良好的疫苗开发前景。

一种新型火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建与鉴定

拟构建一种新型火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组细菌人工染色体(BAC),通过同源重组方法将mini-F载体插入HVT基因组的糖蛋白C(glycoprotein C,gC)基因的等位位点得到mini-F重组HVT,提取重组病毒的DNA转入大肠杆菌DH10B细胞,再转入GS1783细胞获得BAC,拯救病毒获得mini-F重组病毒和gC恢复病毒后,与亲本病毒(HVT FC126)比较生长动力学和对鸡马立克病的免疫效力。结果:获得数个BAC阳性克隆,取其中一个克隆(BAC^(HVT-G))成功拯救出HVT mini-F重组病毒(HVT^(BAC-ΔgC)),并成功获得了gC恢复毒株(HVT^(BAC-gC-R))。生长特性和免疫效力试验表明HVT^(BAC-gC-R)与HVT FC126无显著差异,而HVT^(BAC-ΔgC)增殖能力和免疫效力均明显下降。成功构建了HVT全基因组的感染性BAC;HVT的gC基因是一个非必需基因,但对病毒的增殖能力和免疫效力有重要影响。

鸭瘟病毒LH2011强毒株部分基因序列的测定与分析

为了分析鸭瘟病毒LH2011强毒株部分基因序列的特征。设计6对特异性引物,应用PCR方法扩增鸭瘟病毒强毒株LH2011株的LORF11、UL47、UL41、UL12、UL2和US10序列,然后对PCR产物进行序列测定,并与已发表的鸭瘟病毒的同源序列进行比较。序列分析结果显示,LH2011株LORF11同源子与中国强毒株CHv中有相同的结构,而与欧洲强毒株(2085株、Jansen株、Holland株和D11-JW-016株)和中国疫苗株(VAC株和Clone-03株)存在较大差异,发生了大片段碱基插入,使其被分为LORF11A和LORF11B 2个开放阅读框(ORF)。UL47、UL41、UL12、UL2和US10序列与德国强毒株2085株完全一致,其中UL2序列与N3株、LS株、N2株、N1株、2085株和CHv株6株强毒株均一致,而在Attenuated strain 2株、Attenuated strain 1株、Clone-03株和VAC株4个弱毒株中都缺失了一个528 bp的大片段。表明:LH2011株具有强毒株的基因型特征,提示弱毒株中LORF11同源子和UL2发生的大片段碱基缺失很可能与病毒的毒力减弱直接相关。

鸭瘟鸡胚化弱毒株细菌人工染色体的构建与鉴定

为了构建鸭瘟鸡胚化弱毒株DEV(atten)的细菌人工染色体(BAC),将转移载体质粒pDEVgC-pHA2DNA和DEV(atten)DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行重组,通过三轮挑斑纯化,以获得纯化的鸭瘟重组病毒。将纯化的鸭瘟重组病毒的DNA电转化到E.Coli DH10B中,对获得的克隆用酶切、PCR方法进行鉴定并测序。提取阳性克隆的DNA转染CEF,以拯救重组病毒。再通过将带有相同同源臂和UL44(糖蛋白质C,gC)基因的片段和阳性克隆的DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组,以获得gC恢复病毒。采用0.01感染复数(MOI)感染CEF对亲本病毒、恢复病毒进行多步法生长曲线测定,比较其有无差异。结果显示:成功获得了DEV的mini-F重组病毒,命名为DEV(atten)-mini-F,获得2个阳性克隆S1、S2,将S1命名为pDEV(atten),应用pDEV(atten)拯救重组病毒获得gC恢复病毒DEV(atten)ΔgC-R,生长特性的结果显示亲本病毒与恢复病毒间无显著性差异。表明成功构建的DEV(atten)的细菌人工染色体为全基因组的感染性克隆。

猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究

本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。

基于Shiro的加密机制研究

大数据时代,各种各样的数据资源存储在开放的网络中,存在许多安全隐患,特别是应用系统中的用户隐私数据有较大的泄露风险。数据加密可以有效保护信息在传输和存储环节的安全,从而减少或避免网络信息数据被更改和泄露的问题。Apache Shiro是一个Java安全框架,提供身份验证、授权、加密和会话管理特性,其加密机制有助于保护敏感信息免受未经授权的访问,并确保数据的机密性和完整性。

几株伪狂犬病病毒的增殖特性与保存条件

高滴度的抗原是制备优质疫苗的首要条件。对6株伪狂犬病病毒在仓鼠肾(baby hamster kidney,简称BHK)细胞和猪睾丸细胞(swine testicular,简称ST)细胞上的增殖效率进行了比较,同时测定不同保存温度和冻融条件对病毒滴度的影响。结果表明,几株伪狂犬病病毒在BHK细胞和ST细胞上增殖效率均很高,可达到生产要求。相较于ST细胞,各毒株在BHK细胞上出现病变时间更早。然而,所有毒株在ST细胞上的病毒滴度都高于同期在BHK细胞上的滴度。强毒株AH02LA株在2种细胞上滴度可达108.0 TCID 50/0.1 mL以上,表现为发生病变早,病毒增殖快,峰值到来早的特性。通过强毒株AH02LA株获得的基因缺失株LA-A株和自然传代缺失致弱株LA2017株峰值均达108.0 TCID 50/0.1 mL,展现出优良疫苗株的潜质。保存条件试验表明,PRV在-70℃保存30 d和4℃保存12 d内滴度相对稳定,而-20℃保存的病毒滴度下降明显。多次冻融后,滴度有所下降,相较于-70℃,-20℃条件下冻融病毒滴度下降更为显著,建议避免多次冻融。本试验结果可为PRV疫苗抗原在实际生产中制备与保存提供科学依据。

伪狂犬病病毒US3基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶功能的研究进展

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)属于甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属,其基因组约为150 kb,可分为独特长区、内部重复序列、独特短区以及末端重复序列。PRV US3基因位于其基因组的独特短区,属于复制非必须基因,是病毒的重要毒力基因,编码产物是丝/苏氨酸激酶。US3基因编码蛋白是一种多功能蛋白,可参与PRV逃避宿主免疫清除,抑制病毒介导的细胞凋亡,影响病毒粒子在细胞核质中的运输,调动感染细胞肌动蛋白骨架重排,诱导宿主细胞形态改变进而增强PRV在细胞中的传播能力,在病毒生命周期的多个阶段发挥作用。本文综述了PRV US3编码蛋白功能的研究进展,为PRV致病机制的研究提供了参考。

猪源伪狂犬病病毒变异株传代致弱株LA2017株的获得与鉴定

将猪源伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的强毒变异株AH02LA株在鸡胚成纤维细胞上进行连续传代,获得了不同代次的弱毒株,检测其安全性、免疫效力、生长特性及稳定性,并对其gE基因上、下游片段进行测序。对PRV AH02LA株的F151代进行3轮挑斑纯化,获得了1个毒株并将其命名为PRV LA2017株。用该毒株接种(剂量为106.00TCID50/头)试验猪,在接种后14 d内无任何临床症状;在免疫(106.00 TCID50/头)后21 d攻毒(106.50TCID50/头),所有试验猪未出现任何猪伪狂犬病症状,体温正常,没有排毒。在攻毒前用ELISA检测,PRV gB抗体全部为阳性,PRV gE抗体全部为阴性;在攻毒后14 d这两种抗体均为阳性,体现出良好的安全性与保护性。对照组BarthaK61在攻毒后试验猪全部发病,体温高至40.5℃以上,且均检出排毒。测序结果显示LA2017株的gI部分基因与gE全部基因缺失。该毒株在CEF细胞及ST细胞上生长良好,在CEF上的滴度达到108.0TCID50/mL,在ST细胞上的滴度最高达109.5TCID50/mL,能满足活疫苗生产的要求。LA2017株安全性好,免疫效力强,生长滴度高,可以作为研制针对PRV变异株疫苗的候选毒株。

猪源伪狂犬病病毒AH02LA株糖蛋白的基因序列测定与对比分析

为了分析猪源伪狂犬病病毒AH02LA株糖蛋白的基因序列特征,本研究设计了17对特异性引物,通过PCR扩增AH02LA株的11个糖蛋白基因并进行序列测定,然后将其与PRV变异株(TJ株与HeN1株)和PRV经典株(Bartha株与Kaplan株)作比对分析。结果:成功扩增了11个糖蛋白基因序列,序列比对发现,AH02LA株的gB、gD、gG、gK和gM基因与PRV变异株的同源性为100%,而与PRV经典株的同源性为98%~99%;AH02LA株的gC、gE和gI基因与PRV变异株的同源性为99%,而与经典株的同源性为95%~97%,而且AH02LA株的gB、gC、gD、gE、gI和gN基因的插入或缺失也与变异株完全一致。研究表明,AH02LA株的主要糖蛋白基因序列与变异株高度同源,该毒株是一株典型的变异株。

猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）,命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高（99.5%~100%）,而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。

谈农宅用苯板建造复合保温墙

由于农村能源紧张、运输不便，长期以来农村仅依靠柴草、生物质能源取暖，以最低的取暖标准过冬。因此，农民冬季取暖就成了当前急需解决的难题。为了解决这一难题，提高农民越冬的生活条件。在宝山乡、兴塔村(省农房试点村)农民住宅设计中采用了苯板添缝的复合墙体设计方案，为冬季取暖、节约能源投资、减少建房造价起到了良好的社会效益和经济效益。

重建家园——保温墙体与地下燃池节能住宅房设计

今年8月，罕见的洪水过后，为了使广大受灾农民早日重新住上新房，在上级领导的支持下，为灾民设计了一套保温、节能的住宅，为灾民提供了一个合理、经济的居住环境：