CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

抗生物膜感染的群体效应抑制剂

生物膜是微生物群落附着在基质或表面并被自身合成的胞外基质包裹形成的复合物。细菌生物膜为细菌提供保护层,阻止抗生素进入,使细菌表现出抗抗生素能力。据临床统计表明,80%病原菌感染与其群体效应(QS)介导的生物膜相关,因此,要根治病原菌的感染,抑制生物膜的形成至关重要。QS分子参与生物膜形成,而QS抑制剂(QSI)能抑制生物膜形成。该文就QSI在抗生物膜方面的进展进行综述。

随机转座子插入构建甲型副伤寒杆菌启动子文库

目的构建携带氯霉素乙酰转移酶(CAT)的转座子自杀性质粒,通过接合转座获得甲型副伤寒沙门氏菌(副甲)启动子文库。方法 PCR扩增CAT的基因亚克隆至pMD-18T载体,鉴定正确后酶切插入转座子自杀性质粒pSC189,获得新的转座子载体pSC-CAT,将携带pSC-CAT的供体菌与副甲受体菌进行接合转座,涂布氯霉素平板筛选转座的细菌,以随机筛选出来的细菌基因组为模板,热不对称PCR扩增插入位点侧翼序列,并进行测序、比对分析。结果筛选获得约1000个突变菌,随机挑取6个菌,转座子插入位点的上游分别对应6个可疑启动子区域。结论通过自杀性转座子载体pSC-CAT可高效获得副甲菌启动子文库,为进一步研究副甲菌基因表达与调控奠定了基础。

LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立

构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Bam HⅠ位点,获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与p UT18C共转入BTH101,检测诱饵质粒自激活作用,并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态,PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体p KT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍,满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体p KT25-gp22,筛选文库质量良好,可应用于细菌双杂交实验。

甲型副伤寒沙门菌噬菌体LSPA1启动子筛选方法的建立

目的:通过构建p CAT3启动子陷阱载体筛选甲型副伤寒沙门菌噬菌体LSPA1启动子。方法:PCR无义突变去除p CAT2载体骨架上CalⅠ酶切位点,并在CAT片段的5’端引入CalⅠ的酶切位点,构建启动子陷阱载体p CAT3。TaqⅠ酶切噬菌体LSPA1基因组,插入p CAT3载体中,转化至大肠杆菌DH5α,通过氯霉素抗性平板筛选获得噬菌体LSPA1基因文库菌;随机挑取1株提取质粒,测序及比对分析插入序列;根据分析结果设计引物,扩增可能的启动子序列,并插入验证载体p-3lysm-egfp,转化DH5α,荧光显微镜观察。结果:成功构建p CAT3启动子陷阱载体,获得约100启动子文库菌,其中1株文库菌质粒中随机插入片段可能对应噬菌体LSPA1的ORF4启动子;插入待验证DNA片段的p-3lysm-egfp载体重组菌在荧光显微镜下能见到明显绿色荧光。结论:该启动子文库可有效筛选噬菌体LSPA1启动子,为进一步深入研究噬菌体LSPA1提供帮助。

F_(212-489)-3LysM融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示

探索C端融合有锚定序列3Lys M的呼吸道合胞病毒F截短蛋白(F212-489),能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。采用PCR方法扩增f212-489及3lys M基因,分别亚克隆至p MD18-T载体,在亚克隆载体中酶切回收上述两片段,插入p ET28a构成p ET28a-f212-489-3lys M,酶切鉴定并测序正确后转化BL21(DE3),经IPTG诱导获得的包涵体蛋白进行溶解、复性,将复性后的F212-489-3Lys M与乳酸乳球菌MG1363体外混合,通过全菌ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay)检测融合蛋白吸附菌体的情况。成功构建重组菌p ET28-f212-489-3lys M/BL21(DE3),该菌诱导后F212-489-3Lys M主要以包涵体形式表达,F212-489-3Lys M与MG1363混合后,经全菌ELISA检测,F212-489-3Lys M组OD450远高于对照组,且差异非常显著(P<0.01)。证明经大肠杆菌表达的重组蛋白F212-489-3Lys M经体外混合可展示于乳酸乳球菌MG1363表面。

抗噬菌体甲型副伤寒沙门菌突变菌的构建及其生物学特性

目的:采用同源重组基因敲除方法构建3株甲型副伤寒沙门菌(副甲)抗噬菌体突变菌,并研究其生物学特性。方法:通过PCR和融合PCR方法获得了2、3、5号同源臂片段,经酶切后与pYG4载体连接,构建pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒。经PCR测序鉴定正确后,与野生型副甲菌进行同源重组,获得2、3、5号3株抗噬菌体突变菌。将3株突变菌和野生型副甲菌经不同种类和浓度的抗生素、不同pH值和温度及不同浓度的盐离子处理后,测量菌株的A595值,分析3株突变菌对抗生素、温度、pH值和盐离子的敏感性以及生长曲线。结果:PCR和融合PCR扩增出3个同源臂,构建的pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒经PCR测序表明构建成功;同源重组和抗噬菌体验证表明成功获得3株抗噬菌体突变菌。3株突变菌产生了卡那霉素抗性,且对链霉素表现出敏感性;2号菌表现出氨苄青霉素抗性,5号菌表现高温度耐受性;与野性型副甲菌比较,3株突变菌的生长曲线明显平缓,尤以2号突变菌最为突出。结论:成功构建抗噬菌体突变菌,并获得一些特殊的生物学特性。

甲型副伤寒杆菌抗噬菌体及生物膜形成基因的筛选及鉴定

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)与大部分的细菌感染相关,有助于病原菌抵抗外部不利的环境,包括抗生素和抗噬菌体等.为了研究生物膜和抗噬菌体的作用机制,本文以6株抗噬菌体甲型副伤寒杆菌(副甲菌)突变菌作为研究对象,在Rif+(利福平)(200 mg/L)平板中划线并滴加噬菌体验证能否抗噬菌体,将6株突变菌接种于96孔板中,每组3个重复,观察其成膜能力以及生物膜的形态,定点突变和互补实验验证突变菌的噬菌体抗性是否由突变基因所引起.结果显示:划线平板中野生型副甲菌在滴加1.2×106个噬菌体处出现空缺,而6株突变菌在滴加2.4×109个噬菌体后仍能生长,表明6株突变菌具有抗噬菌体特性;6株突变菌中,σ-54依赖的翻译调节器突变菌成膜能力(A595=1.1±0.2)较野生型副甲菌(A595=0.5±0.1)显著性增强,且差异显著(P<0.05),光学显微镜下菌体聚集成粗大的不规则团块;同源重组敲除野生型副甲菌σ-54依赖的翻译调节器,突变菌出现噬菌体抗性,将表达σ-54依赖的翻译调节器的载体转化该突变菌,突变菌又恢复了噬菌体敏感性.结果表明,σ-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜形成相关的基因.

FQ-PCR与IMSA检测转基因豆奶外源基因的比较研究

为比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与等温多自配引发扩增(IMSA)技术检测转基因豆奶中外源基因(CaMV35S、NOS、EPSPS)的灵敏度和特异性。合成CaMV35S、NOS以及EPSPS基因的质粒,通过FQ-PCR与IMSA检测定量的质粒,比较质粒灵敏度;按0. 50%、0. 10%、0. 05%以及0. 01%的比例制作转基因豆奶,通过FQ-PCR与IMSA检测转基因大豆标准品制成的豆奶,比较样品灵敏度和特异性。结果表明:IMSA检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的质粒灵敏度分别为31. 01,31. 01,3. 10 cps·μL^(-1),FQ-PCR检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的质粒灵敏度皆为31. 01cps·μL^(-1); IMSA检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的样品灵敏度分别为0. 05%、0. 05%、0. 01%,FQ-PCR检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的样品灵敏度皆为0. 10%; FQ-PCR非特异性检出DP356043的NOS以及MON87701的CaMV35S与EPSPS。说明IMSA方法检测转基因豆奶外源基因(CaMV35S、NOS、EPSPS)的灵敏度与特异性优于FQ-PCR。

带锚定基序3LysM的EGFP融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示

目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化的3LysM-EGFP与乳酸乳球菌进行体外混合作用,荧光显微镜及Western-blot检测展示效果。结果成功构建表达重组菌pET28a-3LysM-egfp/BL21并诱导出可溶性3LysM-EGFP,纯化后蛋白纯度达到81.5%,荧光显微镜及Western-blot均检测到展示的目的蛋白。结论纯化后的3LysM-EGFP能在体外条件下展示在乳酸乳球菌表面。

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。

乳酸乳球菌组成型表面展示载体的构建及鉴定

目的探索融合有Usp45信号肽和3Lys M锚定序列的EGFP蛋白能否通过p32启动子组成型展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法融合PCR法分别将p32启动子与Usp45信号肽、3Lys M与egfp基因融合亚克隆至p MD-18T载体,鉴定正确后命名为18T-p Usp45、18T-3Lys M-egfp,分别将上述片段切下依次插入p MG36e构建p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp。将其转化入乳酸乳球菌MG1363,荧光显微镜观察及SDSPAGE、Western-blot检测。结果成功构建重组菌p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp/MG1363,荧光显微镜、SDSPAGE和Western-blot检测表明重组蛋白能在MG1363中组成型表达,且分泌至胞外并锚定在细胞壁上。结论成功地构建了组成型表面展示载体p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp,重组蛋白能分泌至胞外且展示在MG1363细胞壁上。

phoA为报告基因的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库的建立及初步鉴定

目的：构建以phoA为报告基因的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库。方法构建了以phoA为报告基因的“启动子陷阱载体” pPhoA，将甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA的随机酶切片段（500～1500 bp）连接到载体上，启动phoA表达产物与BCIP产生蓝色反应筛选启动子，经过PCR、测序、比对等分析文库质量。结果库容量达到30000个，覆盖基因组全长的2.6倍，同时验证了4个能够在加入BCIP的平板中表现出蓝色的菌落，发现了4个启动子插入片段。结论成功构建高质量的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库，为进一步研究甲型副伤寒沙门氏菌的基因表达与调控奠定了基础。

甲型副伤寒沙门菌PagC蛋白在乳酸乳球菌中的表达研究

目的构建能够表达甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白(Pag C)的乳酸乳球菌。方法 PCR扩增pag C基因,亚克隆至p MD18-T载体并测序,从亚克隆载体中酶切回收pag C基因,插入p MG36e并命名为p MG36e-pag C,转化乳酸乳球菌MG1363。溶菌酶加超声的方法破碎重组乳酸乳球菌,SDS-PAGE以及Western blot检测Pag C蛋白的表达。结果 p MG36e-pag C鉴定正确,Western blot检测到p MG36e-pag C/MG1363表达的Pag C蛋白。结论成功构建能组成型表达Pag C蛋白的乳酸乳球菌。

甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体PSPA1感染宿主相关基因分析

目的分析影响甲型副伤寒沙门氏菌（副甲）噬菌体（PSPA1）感染宿主相关基因。方法诱导副甲利福平抗性株（副甲Rif^＋）；将副甲Rif^＋与SM10λpir／pSC189接合转座，噬菌体PSPA1处理转座菌液后，涂布卡那霉素、利福平双抗平板筛选转座突变菌；提取抗噬菌体突变菌基因组，热不对称PCR、回收片段并测序；测序结果提交NCBI进行序列比对，确定转座质粒插入副甲基因组的位点。结果成功诱导出副甲Rif^＋；筛选到6株抗噬菌体的突变菌；测序、NCBI比对发现6个不同的插入基因。结论利用转座子插入获得抗噬菌体感染甲型副伤寒沙门氏菌突变体，对这些突变体进行PCR、测序分析，说明可能有6个基因及相应的酶或蛋白与抗噬菌体相关，为进一步分析噬菌体与寄主菌相互作用关系提供基础。

宿主菌抗噬菌体机制的研究进展

噬菌体又称细菌病毒,是公认最丰富的微生物,也是最多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制。噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,就会面临细菌抗噬菌体的机制,宿主菌能够进化出多种抗噬菌体的机制来避免噬菌体的侵染和裂解。本文就对宿主菌抗噬菌体各种机制作一综述。

与甲型副伤寒杆菌噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白的筛选

目的筛选与甲型副伤寒杆菌（副甲）CMCC50973噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白。方法 Sau3AⅠ酶切副甲基因组,回收250-1 500 bp的条带与p AT质粒连接,构建p AT-副甲基因文库;扩增噬菌体早期基因gp23,与p BT构建p BT-gp23作为诱饵质粒;将p AT-副甲基因文库和p BT-gp23共转KS宿主菌,利用细菌双杂交技术筛选蓝色单菌。检测筛选出阳性单菌的Lac Z活性,并提质粒测序,分析其编码蛋白。结果成功构建副甲基因文库,其库容量满足实验的要求,基因文库阳性率接近100%;筛选出的插入基因为编码嘌呤透性酶。结论宿主蛋白（嘌呤透性酶）可能与副甲噬菌体LSPA1早期蛋白GP23有相互作用。