新生BALB/c小鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立

目的:经改良和优化,建立高纯度BALB/c小鼠大脑皮质神经元培养的方法。方法:采用L-多聚赖氨酸包被细胞培养板,取新生BALB/c小鼠(出生24 h内)大脑皮质组织,经0.25%胰酶消化后吹打成单个细胞,按1×106/孔接种于35 mm的六孔板中,用神经元细胞培养种植液培养6 h后换神经元细胞培养饲养液,培养40 h时加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长,随时观察神经元培养情况。结果:培养5 d的神经元细胞形态最为典型;经免疫荧光方法鉴定,神经元细胞纯度为93%。结论:经方法改良与优化,获得了高纯度的原代培养小鼠大脑皮质神经元细胞。

B16黑色素瘤皮内移植瘤模型的建立

背景与目的:建立B16黑色素瘤细胞(简称B16细胞)皮内移植瘤模型。材料与方法:制备商品源B16细胞悬液,按每只C57BL鼠接种0.1 ml(3×105个)B16细胞于后肢外侧皮内;分离、培养移植瘤源B16细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。结果:移植瘤出现时间为(9.6±1.2)d,致瘤率为100%;皮内注射B16细胞18 d内,肿瘤形态呈圆形或类圆形,边缘清楚;移植瘤源原代B16细胞多为圆形、类圆形或短梭形,商品源B16细胞为梭形或不规则形;HE染色表明移植瘤内有大量B16细胞。结论:B16细胞皮内移植瘤模型易于对肿瘤生长的观察和测量,是早、中期肿瘤研究的合适模型之一。

小鼠IL-17基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆小鼠IL-17(mIL-17)基因编码区并构建其真核载体。方法将10 ug LPS和等体积的完全福氏乳化后免疫C57BL/6小鼠,7 d后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增mIL-17基因全长编码区并将其克隆至pcDNA3.1载体。菌落PCR筛选阳性克隆,限制性内切酶消化和序列分析进行鉴定。结果构建的重组载体中含有mIL-17基因编码区的全长序列,与NCBI公布的序列一致。结论获得mIL-17基因并构建了其真核表达载体,为研究IL-17在自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。

LPS刺激神经胶质细胞条件培养上清诱导神经元凋亡

目的研究经脂多糖(LPS)刺激后神经胶质细胞培养上清对神经元死亡及凋亡的诱导情况。方法体外原代培养小鼠混合神经胶质细胞和神经元细胞,采用LPS刺激神经胶质细胞,24h后收获条件培养上清与神经元细胞共孵育,检测神经元细胞死亡和凋亡的情况。结果 LPS刺激后的神经胶质细胞培养上清对神经元的毒性作用与未刺激组无明显差别(P>0.05);LPS刺激后的神经胶质细胞条件培养上清诱导神经元细胞凋亡明显高于未刺激组(P<0.05)。结论神经胶质细胞LPS刺激后的条件培养上清可以诱导神经元凋亡,但没有导致明显的神经元细胞死亡。

β-淀粉样肽对原代培养小鼠大脑皮质小胶质细胞形态学及细胞因子表达的影响

目的:研究原代培养的BALB/c小鼠大脑皮质小胶质细胞经β-淀粉样肽1-42(Aβ1-42)刺激后的形态学变化及细胞因子表达情况。方法:小胶质细胞用2次温和胰酶消化法分离,经预处理的Aβ1-42刺激后,相差显微镜观察形态学改变,RT-PCR检测IL-1β、-6基因表达水平。结果:小胶质细胞经Aβ1-42刺激后6 h细胞形态学发生明显改变;刺激24 h后IL-1β、-6基因表达水平明显上调(P<0.05)。结论:Aβ1-42可明显活化小胶质细胞,并诱导炎性细胞因子的表达。

脂多糖预刺激对大脑皮质星形胶质细胞和小胶质细胞NO分泌水平的影响

目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)预刺激对大脑皮质星形胶质细胞和小胶质细胞NO分泌水平的影响。方法:体外分离、纯化、培养星形胶质细胞和小胶质细胞。培养细胞分设LPS预刺激组(先用10ng/ml LPS预刺激18h后,改用1μg/ml的LPS再刺激),LPS 10ng/ml单次刺激组,LPS 1μg/ml单刺激组与对照组(不用LPS刺激)。分别于LPS刺激后6、24、48h收集细胞培养上清,用硝酸还原酶法检测NO水平。结果:星形胶质细胞和小胶质细胞,LPS预刺激组在24h后,NO水平增加,明显高于相应时间点LPS 1μg/ml单次刺激组(P均<0.05);其中,星形胶质细胞分泌NO的时间较长,可持续到48h,与相应单次刺激组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:LPS体外预刺激神经胶质细胞,可促使细胞分泌NO的水平升高。

LPS诱导大脑皮质胶质细胞自噬基因Beclin-1蛋白表达的研究

目的:探讨脂多糖(lipppolys accride,LPS)刺激对大脑皮质胶质细胞自噬相关基因Beclin-1蛋白表达的影响。方法:体外分离新生小鼠大脑皮质混合胶质细胞,采用1 μg/ml LPS刺激24h后收集细胞与培养上清。Western blotting检测Beclin-1蛋白表达水平;CCK-8试剂盒检测细胞增殖率。结果:LPS刺激后,大脑皮质混合胶质细胞Beclin-1蛋白表达水平增高,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);细胞增殖率下降,与对照组比较差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论:LPS能激活神经胶质细胞自噬相关基因Beclin-1,这种变化参与调节了胶质细胞的存活情况。

急诊儿科惊厥病因的流行病学研究

目的:分析急诊儿科患儿惊厥的病因特点,提高急诊儿科对惊厥病因的快速识别和干预水平。方法:回顾性分析2018年1月1日至2019年12月31日急诊儿科因惊厥就诊2881例患儿的临床资料。结果:两年中,因惊厥就诊共2881例,最常见病因是热性惊厥1675例(58.1%),其次为癫痫908例(31.5%)、第三位脑炎及脑病174例(6.0%),第四位是轻度胃肠炎并良性婴幼儿惊厥108例(3.7%)。脑炎和脑病中极危重症10例,其中8例死亡。不同年龄段惊厥及其病因占比存在差异,惊厥的发生以1-3岁婴幼儿比例最高(54.4%),0-6岁患儿惊厥的首要病因为热性惊厥,而6-14岁患儿的首要病因则为癫痫。共收住院903例(31.3%),其中需进入重症监护室189例(占住院人数20.9%)。结论:惊厥在儿科急诊就诊患者中常见,但不同年龄段惊厥的原因存在差异。婴幼儿和学龄前期儿童多为热性惊厥,学龄期儿童惊厥的原因多为癫痫。病因为脑炎及脑病的患儿往往病情危重,病死率高。不同病因导致患儿预后亦各不相同,因此,快速准确地评估病情及识别病因对管理惊厥患儿至关重要。

儿童误服中毒的临床研究

目的通过临床资料分析,以减少儿童因误服中毒导致的意外伤害事件发生。方法通过分析汕头市中心医院急诊儿科2018年8月至2019年7月期间儿童误服中毒病例的临床资料,了解其误服中毒药物品种特点、年龄、性别差异、季节差异、区域特点。结果总计44例,男29例(65.9%),女15例(34.1%);1~3岁幼儿高发,共32例(72.7%);来自农村37例(84.1%),城市7例(15.9%);33例(75.0%)发生误服中毒时由老人看管,11例(25.0%)例由父母看管时发生;误服中毒药物品种有抗高血压药、抗精神病药、煤油、含农药青菜或食物、松节水、消毒剂等。结论从婴儿期有主动抓拿意识开始,家长应高度警惕预防误服药物可能,特别是农村地区由老人看护儿童者,建议通过医院、幼儿园、社区、媒体宣教,针对不同年龄阶段加强家长安全教育常识等措施,从家庭看护人、政府、医疗机构等各方面有效防范儿童误服药物的发生。

重叠延伸PCR法构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体

目的:构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体。方法:将10ugLPS和等体积的完全福氏佐剂乳化后皮下注射C57BL/6小鼠,7天后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35cDNA;采用重叠延伸PCR,通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3全长基因和IL-12p35成熟肽基因,构建小鼠IL-35单链融合基因(mouse sigle chain IL-35,mscIL-35),并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His訫TOPO誖TA载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体。结果:DNA序列分析结果表明:小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确。结论:成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体,为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础。

脂多糖活化小鼠大脑小胶质细胞后炎性细胞因子的表达

目的采用细菌脂多糖(LPS)对原代培养的BALB/c小鼠大脑皮质小胶质细胞进行刺激,检测小胶质细胞IL-1bI、L-6和TNF-α等细胞因子的基因表达情况。方法分离纯化小胶质细胞,采用1μg/ml LPS刺激24h,再采用RT-PCR检测IL-1bI、L-6和TNF-a mRNA表达水平。结果体外培养的小胶质细胞经LPS刺激后,细胞因子IL-1bI、L-6和TNF-a mRNA表达水平明显上调。结论 LPS活化的小胶质细胞可产生大量的炎性细胞因子。

流感病毒感染小鼠星形胶质细胞诱导GDNF转录水平上调

目的探讨星形胶质细胞感染流感病毒后的神经保护效应,检测流感病毒H3N2和H9N2体外感染小鼠星形胶质细胞是否会诱导胶质细胞神经营养因子转录水平的改变。方法从新生小鼠大脑皮质分离培养神经胶质细胞,并进一步纯化星形胶质细胞,经纯度鉴定后,用感染复数为2的流感病毒H3N2和H9N2进行体外感染。在感染早期(6h)和感染中后期(24h)分别提取细胞RNA,real-time PCR检测神经营养因子转录水平的变化。结果病毒感染后的星形胶质细胞显著上调GDNF转录水平的表达,NGF,BDNF,NT-3转录水平变化不明显。H3N2和H9N2感染星形胶质细胞表达的细胞因子变化情况一致。结论流感病毒H3N2和H9N2感染星形胶质细胞可诱导神经营养因子GDNF转录水平的上调。

A型流感病毒不同亚型/毒株NS1蛋白之间的异源性相互作用

流感病毒NS1蛋白在调控宿主免疫反应和促进病毒复制过程中发挥了重要作用.形成同源二聚体或寡聚体对于NS1蛋白有效发挥生物学功能是必要的.本研究发现流感病毒株A/Shantou/602/06(H3N2)的NS1蛋白(NS32)能够与流感病毒株A/Shantou/169/06(H1N1),A/Chicken/Guangdong/1/05(H5N1)以及A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)的NS1蛋白(NS11,NS51和NS92)相互作用,尽管NS32与NS11,NS51和NS92之间存在17.4%～20.9%的氨基酸序列差异.这表明,A型流感病毒不同亚型/毒株NS1蛋白之间的异源性相互作用可能是流感病毒共感染过程中的一个常见事件.

LPS预激神经胶质细胞培养上清对神经元的影响

目的探讨神经胶质细胞经过脂多糖(Lipopolyssacride,LPS)预激后,其培养上清对神经元功能的影响。方法体外培养神经元与神经胶质细胞,免疫荧光法进行纯度鉴定。神经胶质细胞分为4组:未刺激对照组、0.01μg/ml LPS单次刺激组、1μg/ml LPS单次刺激组、预刺激组(先采用0.01μg/ml LPS刺激18h后,再用1μg/mlLPS刺激24h)。经过相应处理后收获各组条件培养上清,分别加入到神经元中,与神经元共同孵育24h后收集细胞与培养上清。采用CCK-8试剂盒与ELISA法检测神经元的存活率和分泌TNF-α、IL-6水平。结果星形胶质细胞预刺激组条件培养上清作用于神经元后,细胞存活率下降,与0.01μg/ml、1μg/ml LPS单次刺激组比差异均具有统计学意义(P<0.05);小胶质细胞各组条件培养上清作用于神经元后,细胞存活率变化不明显(P均>0.05);在星形胶质细胞各刺激组上清作用下,神经元产生TNF-α的水平,各LPS处理组培养上清刺激下水平升高,其中1μg/ml LPS单次刺激组升高明显,与对照组和0.01μg/ml LPS单次刺激组比差异具有统计学意义(P均<0.05);产生IL-6的水平亦升高,与对照组比亦均具有统计学差异(P<0.05或P<0.01);并且,预刺激组较1μg/mlLPS单次刺激组上清作用后,产生IL-6水平较低(P<0.05)。各组小胶质细胞条件培养上清作用于神经元后,产生TNF-α的水平,预刺激组水平升高明显,与对照组比差异具有统计学意义(P<0.01);对于IL-6水平,变化趋势同TNF-α,但各组间差异无统计学意义(P>0.0.5)。结论 LPS预激参与重新调配了神经胶质细胞分泌活性介质的作用,培养上清中这些分子相互制约或是协同,对神经元产生有可能是保护或是损伤效应。

脂多糖刺激对小鼠大脑皮质混合胶质细胞产生HMGB-1的影响

目的用革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccride,LPS)刺激大脑皮质混合胶质细胞,检测高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)的表达情况与转位作用,了解HMGB-1与其他炎性介质相互作用参与神经胶质细胞介导脑部炎症反应的机理。方法体外培养小鼠大脑皮质混合胶质细胞,采用1μg/ml LPS刺激,收集细胞以及培养上清,Westernblotting检测混合胶质细胞HMGB-1的蛋白水平;免疫荧光法检测HMGB-1的转位情况;Griess法检测培养上清中NO的水平。结果 LPS刺激下,大脑皮质混合胶质细胞HMGB-1的蛋白表达水平增加并向胞浆中移位,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);NO与HMGB-1变化趋势一致,水平增加,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LPS刺激模拟革兰阴性菌感染,大脑皮质混合胶质细胞产生的HMGB-1与NO协同参与了其介导的脑部炎症反应。

脂多糖刺激星形胶质细胞SOCS-3及促炎性细胞因子的表达

目的以脂多糖(lipopolysaccride,LPS)刺激,模拟革兰阴性菌感染,观察体外培养大脑皮质星形胶质细胞分泌某些促炎性细胞因子及负性调控分子的变化,为进一步了解脑部炎症中星形胶质细胞的调节机制提供更丰富的实验依据。方法采用改良McCarthy法体外对大脑皮质星形胶质细胞进行培养,抗GFAP抗体荧光鉴定纯度后,用10ng/ml LPS刺激24h后收集细胞和培养上清,Western blotting检测SOCS-3(Suppressor of Cytokine Signaling-3,SOCS-3)蛋白水平,ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-6水平。结果 LPS刺激24h后,星形胶质细胞中SOCS-3有升高趋势,但与正常对照比较差异无统计学意义(P>0.05);星形胶质细胞培养上清中IL-6和TNF-α的水平明显升高,与正常对照比较差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论 LPS刺激能有效促进星形胶质细胞分泌促炎性细胞因子;SOCS-3的表达与星形胶质细胞分泌细胞因子的变化密切相关,是调控星形胶质细胞适度产生促炎性细胞因子的重要负反馈因子。

2014-2018年汕头市某医院就诊儿童伤害病例特征

目的了解医院就诊儿童伤害特征,为开展儿童伤害的预防与控制工作提供科学依据。方法采用描述流行病学分析方法对汕头市某医院2014—2018年因伤害就诊儿童病例进行分析。结果2014—2018年汕头市某医院急诊就诊14岁及以下儿童伤害病例共8934例,5年间该医院急诊伤害儿童病例数大致相当,分别占17.5%、20.4%、18.7%、20.9%、22.5%。以<6岁(占69.7%)、男童为主(占65.0%),男女比例为1.86∶1。<6岁病例全年伤害分布大致相当,6~14岁儿童第一季度和第四季度所占比例较大(分别占30.2%、25.9%)。9∶00~11∶00、19∶00~22∶00是伤害发生的2个高峰。伤害部位以头部为主(占74.7%),伤害原因以跌倒/坠落为主(占79.9%)。结论汕头市各年伤害发生人数大致相当,全年均可发生,伤害发生时间与户外活动时间较一致,建议相关部门应根据儿童伤害特征制定相关健康教育措施。