一株牛分枝杆菌的分离与鉴定

采集一头检疫阳性的结核牛病变的淋巴组织进行细菌分离。分离物(Z-N)染色为阳性。提取细菌DNA,用PCR检测结核分枝杆菌特异性插入片段IS1081,确定该细菌为结核分枝杆菌。将PCR扩增出的特异性片段克隆到PMD-18T载体上。重组质粒经酶切和PCR鉴定均为阳性,测序结果与牛分枝杆菌标准菌株的同源性为100%。对其用Richard C.Huard等公布的PCR分型方法设计引物进行基因分型,确定该菌株为牛分枝杆菌BCG(M.bovis BCG)。

牛分枝杆菌ESAT-6蛋白抗体间接ELISA方法的建立

利用分子克隆技术,提取结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因,然后对其进行克隆表达,获得高效表达的ESAT-6蛋白,Western blot证实ESAT-6蛋白可与结核牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的ESAT-6重组蛋白作为诊断抗原建立的间接ELISA特异性为94%、敏感性为63.35%。交叉反应试验表明,该抗原只与牛副结核病阳性血清有交叉反应,而不与其他5种常见的牛病阳性血清发生交叉反应。用间接ELISA方法对285份PPD阳性牛血清、对74份PPD阴性牛血清、79份牛γ-干扰素(IFN-γ)检测阳性血清进行检测,其负荷率分别为62.1%、98.64%、83.54%。实验结果表明建立的间接ELISA方法可以用于牛结核病感染和免疫抗体检测,且具有很好的开发和应用前景。

牛结核杆菌DNA疫苗的纯化工艺研究及质量鉴定

为获得纯度较高,能进行动物免疫试验的DNA疫苗,在高密度发酵工程菌的基础上,通过传统的碱裂解,获得粗提的质粒;用氯化钙去除裂解液中的大部分RNA,并用Sartobran P囊式过滤器获得了澄清的溶液。用聚乙二醇法沉淀超螺旋质粒DNA,去除大部分菌体蛋白和宿主DNA。最后用source 30Q阴离子交换色谱填料去除几乎全部的内毒素并浓缩了质粒。本试验纯化的DNA疫苗经质量检验达到了转染动物的要求。该工艺实现了一步色谱纯化DNA疫苗的目的,具有工艺简单、快速的优点。

牛分支杆菌DNA疫苗工程菌的高密度培养研究

对牛分支杆菌三价DNA疫苗工程菌进行了高密度培养的探索。通过摇瓶培养试验对3种培养基进行了筛选,选择出具有高密度培养潜力的半合成培养基作为中试规模的发酵罐培养基;经对培养温度、溶氧、pH、转速、补料方式等各种条件优化,培养的工程菌密度OD600达到22.92,细菌湿重达到27.173 g/L,质粒产量为1.44 mg/g湿菌。试验还对培养物质粒的稳定性进行了证实。

几种牛结核病检疫方法在结核污染牛群中的应用研究

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人畜共患病,皮内变态反应是牛结核病检疫国家规定的检疫方法和有效手段,本文阐述了皮内变态反应与比较变态反应、γ-干扰素检测及病理剖检的相关性和符合率,对确诊结核病阳性牛有一定的指导作用。

特别策划:提高对牛结核病的重视

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium）引起的人、畜、禽共患的一种慢性传染病,由人结核分枝杆菌（MTB）、牛分枝杆菌（MB）、禽型分枝杆菌（M,avium）、非洲分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌（M,microti）所引起,统称这些病原为结核分枝杆菌复合物（或群）。目前已知,结核病除感染人外还能使50多种哺乳动物和25种禽类感染,牛是最敏感的动物。

乌鲁木齐市人畜间结核病的流行病学特点

牛结核病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,是一种人兽共患传染病,可通过病畜传染给人和其他动物。其传播流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。由于卡介苗(BCG)的使用,结核病的发病率比过去有所下降。但近年来该病发病率又呈上升趋势。通过对乌鲁木齐市2007-2010年人畜间结核病的流行病学进行调查,找出结核病流行的规律和特点,为更好地控制结核病的传播提供一定的帮助。

牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。