花生根瘤菌在自生条件下固氮和吸氢相关性

花生根瘤菌x_(-1)菌株在自生条件下和合适的培养基中,可诱导固氮酶及氢酶的活性,固氮酶反应产生的H_2(内源H_2)能直接诱导氢酶,氢酶活性表达的时间进程是在固氮反应之后,在外源H_2的存在下,固氮酶和氢酶则可同时表达,不同有机碳化合物对固氮酶与氢酶的影响不同,丙酮酸明显提高固氮活性,但对氨酶没有促进作用,蔗糖对固氮活性没有促进作用但对吸氢表现促进作用,分子H_2明显提高固氮活性,2.4-二硝基苯酚抑制需H_2的固氮活性,在外源H_2存在下其抑制作用更明显,铵抑制固氮酶的形成、固氮酶受铵抑制时氢酶也相应受到抑制。

大豆和花生根瘤菌氢酶的研究

根瘤菌在共生固氮过程中因放 H2 所消耗的能量约占固氮总能量的 4 0 %～ 6 0 % .吸氢酶则能回收和利用固氮过程所放的 H2 ,减少能量损失 ,从而提高共生固氮效率 .在厌氧条件下 ,加入防止酶蛋白聚合的试剂 ,利用 DEAE-纤维素和 Sephacryl S- 2 0 0柱层析 ,从自养性大豆根瘤菌和花生根瘤菌类菌体中分离并提纯膜结合态氢酶 .纯化的两种氢酶表现相近的分子特征 :均含有大 (6 0 k D,6 5k D)、小 (30 k D,35k D)两个亚基 ;均为 Ni Fe-氢酶 ,并具有较高的吸 H2 活性 .大豆根瘤菌氢酶的纯酶组分不含 Cyt b559.花生根瘤菌 L8- 3菌株能进行化能自养生长 ,诱导出高吸 H2 活性 .根瘤菌的吸H2 能明显提高固氮活性 .从具有高吸 H2 活性的花生根瘤菌中分离并克隆吸氢基因 ,采用 PCR和探针杂交技术 ,获得含有吸氢基因的质粒 p Z- 55.利用多种限制性内切酶构建了质粒 p Z- 55的物理图谱 .通过三亲本杂交 ,将含吸氢基因的重组质粒转移到不吸 H2 的花生和毛豆根瘤菌中 ,所获得的结合株在自生和共生条件下均表达吸 H2 活性 .以结合株接种大田花生 ,获得的共生根瘤的吸 H2 活性比接种受体株提高 4倍 ,花生叶片和种子的含 N量、产量分别提高 1.7%、8.9%和 9.6 % .

花生根瘤菌类菌体氢氧化体系的研究

花生根瘤菌类菌体含有吸Ｈ２酶，以Ｏ２或亚甲蓝为电子受体均表现吸Ｈ２活性。类菌体还原减氧化的吸收差示光谱在４２４、５００、５２０、５５０、５６０、５８５及５９５ｎｍ处呈现吸收峰，表明细胞色素ｃ、ｂ、和ｏ参与Ｈ２的氧化过程。ＣＮ－明显影响５２０、５５０、５６０ｎｍ处的吸收峰，意味着有些细胞色素ｃ和ｂ对ＣＮ－敏感，在Ｈ２代谢中充当末端氧化酶的作用。抗霉素Ａ、ＨＯＮＯ、ＣＮ－、Ｎ３－和ＤＢＭＩＢ均强烈抑制吸Ｈ２活性，但鱼藤酮不抑制吸Ｈ２活性。说明细胞色素ｂ、ｃ、ａ和泛配参与Ｈ２氧化的电子传递，而ＮＡＤＨ脱氢酶不参与。花生根瘤菌类菌体的Ｈ２氧化系统是个复杂具分支的电子传递体系。

花生根瘤菌共生吸氢和固氮的某些特性

用花生根瘤菌某些Hup^+和Hup^-菌株作回接,有接种的植株其根瘤数比对照多。所试菌株在共生条件下表现吸氢和乙炔还原活性。离体根瘤 72 h内其吸氧活性表现起初较低,随后逐渐升高,而后又逐渐下降;但乙炔还原活性则随时间的延长逐渐下降。根瘤吸氢依赖于氧并受CO的抑制。10％外源分子氢可提高乙炔还原活性20～60％。不同生长期的吸氢和乙炔还原活性以盛花期为最高。

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

从霉变的玉米芯中筛选到一株高产纤维素酶的菌株,经 18S rRNA基因序列分析和菌株形态特性分析,确定该菌株为灰绿曲霉(Aspergillus glaucus).利用固体纤曲培养产生纤维素酶,研究了培养基起始pH值、培养温度、培养时间、接种量、氮源、稻草粉与麸皮比例、表面活性剂等对菌株产酶的影响.在最适条件下菌株培养 72 h后,羧甲基纤维素酶(CM Case)活力高达6 812 U/g(干曲,下同),滤纸酶活力(FPA)达172 U/g.利用该菌株对蔗渣进行分解,其糖化率达36.4%.

螺旋藻(Spirulina platensis)放氢的研究

螺旋藻含有可逆性氢酶，在合适的条件下能催化放氢．研究表明：当培养基的ｐＨ值为８．５～９．５，气相氧浓度为１％的条件时，能使螺旋藻放氢达到最大效率．外加葡萄糖、蔗糖有利于放氢，葡萄糖、蔗糖的最适浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ，而ａ－酮戊二酸、柠檬酸等对螺旋藻的放氢没有促进作用．

猪脾铁蛋白电子隧道特性及释放铁途径的研究

维生素Ｃ和连二亚硫酸钠混合后只能加速猪脾铁蛋白释放铁的速率，并不能使铁蛋白释放铁的动力学途径由复杂转化为简单．而单独维生素Ｃ却能利用蛋白壳上的电子隧道传递电子，迫使铁蛋白以二分之一的反应级数方式释放整体铁核的铁并起着抗磷酸盐阻遏释放铁速率的作用，简化释放铁的途径．对维生素Ｃ参与铁蛋白释放铁的机理进行了讨论．

马脾铁蛋白释放铁的反应级数和速率相数的转换

采用差示法研究铁蛋白释放铁的动力学规律和反应级数的转换。结果表明：马脾铁蛋白释放铁的速率及相数与还原剂Na2S2O4。浓度及铁还原速率无关，与该蛋白蛋白壳的调节速率有关。在pH50～6．0范围内，马脾铁蛋白以三相不同速率方式释放占原铁核总铁量80％的铁。但在pH9．0介质中，OH-不仅能参与铁蛋白铁核组成，减缓释放铁的速率，而且使原混合级反应转换为一级反应，从而使铁蛋白释放铁的动力学过程由复杂转化为简单。

猪脾和马脾铁蛋白理化特性的比较

Ｈ＋、ＯＨ－均能参与猪脾和马脾铁蛋白铁核组成，迫使它们分别释放铁核中对酸碱不稳定的铁组份。在可见光谱中，猪脾和马脾铁蛋白表现出既相似又可区分的光谱特性，两者铁蛋白释放铁的动力学过程可分为一级快速反应和零级慢速反应，但猪脾铁蛋白释放铁的一级反应速率明显大于马脾铁蛋白释放铁的一级反应的速率，推测这些现象均与各自蛋白的蛋白壳自身调节能力有着密切联系。

光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶小亚基基因的克隆

光合细菌 C.vinosum可溶性氢酶由 52 k Da和 2 1.5k Da两个亚基组成 .该酶大亚基 N-末端氨基酸序列为 :SRTITIEPVTRXEGHAR,小亚基 N末端氨基酸序列为 :STQPKITVATXL DG.根椐大、小亚基 N-末端氨基酸序列设计两套引物 ,Primer1:5′g AT(g/ C) g T g AT(g/ C) g T(g/ A) Cg3′和 Primer2 :5′A g C AC(C/ g) CAg CC(C/ g) AA(g/ A) ATC3′,通过 PCR扩增获得 0 .6 kb的扩增片段 .克隆并对该片段序列进行分析 ,结果表明 ,该片段包含小亚基基因的全序列 .可溶性氢酶小亚基由 179个氨基酸残基组成 ,分子量为 2 1.8k Da,含有 Ni Fe-氢酶保守的序列框 :Cxx C......Gx Cxxx G......

细菌铁蛋白释放铁的动力学研究

棕色固氮菌细菌蛋白在可见光谱区中有定性的特征吸收峰。细菌铁蛋白经过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４还原后，该蛋白的α、β和Ｓ峰的吸光度随着蛋白还原程度增大而递增。细菌铁蛋白的氧化还原状态可分为氧化态、半还原态和深度还原态。细菌铁蛋白铁核中的磷铁组成存在着非均匀性，该蛋白释放铁核表层的铁的反应为一级反应，推测这一过程受蛋白壳中的血红素调控。细菌铁蛋白释放铁核内层的铁的反应为零级反应。

棕色固氮菌细菌铁蛋白释放铁的动力学方程和性质

棕色固氮菌细菌铁蛋白铁核中的磷铁组成存在非均匀性。细菌铁蛋白释放铁的动力学特性表现出复杂性。通过动力学曲线分析，提出蛋白壳自身调节能力起着限制释放铁速率关键步骤的观点，建立分析铁蛋白释放铁的动力学特性方程并用它较合理地阐明铁蛋白释放铁的动力学规律及储存铁的途径。用分光光度法和动力学方程研究细菌铁蛋白释放铁的全过程，其结果表明该蛋白以一级反应方式释放铁核表层的铁和以零级反应方式释放铁核内层的铁。外加磷酸盐能强烈地抑制释放铁的速率，引起释放铁的反应级数的转化，迫使铁蛋白以一级反应的方式释放铁核中的大多数铁。

高等植物放氢的初步研究

高等植物放氢的初步研究张凤章林淑贞龙敏南许良树（厦门大学生物学系厦门３６１００５）自Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ和Ｓｔｉｃｋｌａｎｄ首次在微生物中发现氢酶后［１］，尤其是Ｎａｋｏｓ和Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ第一次从巴氏梭菌分离提纯氢酶以来［２］，氢酶研究有了很大的...

细菌铁蛋白氧化还原特性及电极活性的研究

棕色固氮菌细菌铁蛋白能直接快速地从金属铂电极上得到电子或提供电子给铂电极。经－６００ｍＶ（相对于ＮＨＥ）还原电位处理后，还原态细菌铁蛋白在可见光谱区中（３８０－５８０ｎｍ）所呈现的整体吸收光谱强度明显高于氧化态细菌铁蛋白的吸收光谱强度。经氯化钴处理后的细菌铁蛋白表现出较弱的电极活性及释放铁的速率明显下降。此外，细菌铁蛋白在体外模拟棕色固氮菌整体细胞内的微量氧环境体系中仍有氢还原现象，因而推测细菌铁蛋白在该菌体内也能进行吸氢反应。

光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶的FTIR谱的研究

光合细菌Chromatiumvinosum含有一种可溶性氢酶和一种膜结合态氢酶。氧化态可溶性氢酶在红外光谱区(1860 -2140cm -1)有四个特征吸收峰 (2103.7 ,2086.2,2054.8和1962.5cm -1)。其中1962.5cm -1处吸收带的位置与已知的NiFe -氢酶活性中心 -CO基团所产生的吸收带位置相近 ;另外三条吸收带的位置与已知的NiFe -氢酶活性中心 -CN基团所产生的吸收带的位置相近。以2 ,6 -二氯酚靛酚 (DPIP)氧化可溶性氢酶时 ,四条吸收谱带的位置基本上没有发生变化。可溶性氢酶被Na2S2O4 充分还原时,-CO基团的吸收带移至1946.8cm -1 ,而 -CN基团的三条吸收带中的两条分别移至2076.8cm-1 和2093.1cm-1 处 ,另一条则消失了。还原态可溶性氢酶与CO反应后 ,其红外光谱显示七条吸收带 ,在 -CO基团红外光谱区和 -CN基团红外光谱区各产生了两条新的吸收带。研究表明 ,C.vinosum可溶性氢酶的活性中心的结构类似于其它已知的NiFe -氢酶 ,但与活性中心金属原子相连的可能包括三个 -CN基团和一个 -CO基团 ,结合可溶性氢酶的EPR谱特征 ,推测C.vinosum可溶性氢酶活性中心的结构可能为Ni(CN)Fe(CN)2(CO)。

固氮酶中N_2和N_2O结合位的一种新的鉴定方法

采用ＧＣ和ＧＣ－ＦＴＩＲ法，研究了Ｎ２和Ｎ２Ｏ对固氮酶催化Ｃ２Ｄ２还原活性及产物二氘代乙烯的反式－／顺式－异构体比值的影响，结果表明，Ｎ２和Ｎ２Ｏ均抑制Ｃ２Ｄ２的还原作用，并引起反式－／顺式－１，２－二氘代乙烯比值的增加．这一变化规律，与根据Ｃ２Ｈ２还原被Ｎ２和Ｎ２Ｏ抑制只发生在固氮酶铁钼辅基（ＦｅＭｏｃｏ）的笼内的假设而近似计算的结果相一致．实验结果和理论计算之间的一致性支持Ｎ２和Ｎ２Ｏ结合在ＦｅＭｏｃｏ的笼内。

光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶的EPR研究

光合细菌 Chromatium vinosum可溶性氢酶经 5次柱层析 ( DE-2 3,TSK-DEAE( ) ,Ultragel Ac A-4 4 ,TSK-DEAE( ) ,Superdex TM75 )分离后被纯化 365倍 ,得率为 32 % ,其催化放氢的活性为 8.4μmol H2 /( min· mg prot) .氧化态可溶性氢酶在 4 5 K下 ,产生了 Ni( )的典型 EPR信号 ( gx,y,z=2 .37,2 .1 6,2 .0 1 6和 gx,y,z=2 .30 ,2 .2 3,2 .0 1 6) ;在 1 0 K下 ,没有出现膜结合态氢酶中存在的 [3Fe-4 S]簇特征 EPR信号 .可溶性氢酶被 H2 还原后 ,Ni( )的特征 EPR信号消失 ,同时出现一个 [4 Fe-4 S]簇的特征 EPR信号 ( gx,y,z=1 .88,1 .90 ,2 .0 4 5 ) .研究结果表明 ,C.vinosum可溶性氢酶在结构和功能上不同于膜结合态氢酶 ,是一种新的催化放氢的 Ni

光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶的分离提纯及特性

光合细菌 Chromatium vinosum可溶性氢酶经 4次柱层析 (Whatman DE- 52 ,TSK- DEAE,Ultragel Ac A- 44 ,Mono Q)分离提纯后被纯化 630倍 ,得率为 33.5% .可溶性氢酶催化放氢比活性为 7.5μmol· min-1· mg-1.SDS- PAGE结果显示 ,可溶性氢酶由 52 k D和 2 1 .5k D两个亚基组成 .大亚基 N端氨基酸序列为 :SRTITIEPVTRXEGHAR;小亚基 N端氨基酸序列为 :STQPKIT-VATXLDG.氧化态可溶性氢酶在 54K时产生了典型的 Ni( )电子顺磁共振 (EPR)信号 (gxyz=2 .37、2 .1 6、2 .0 1 6和 gxyz=2 .30、2 .2 3、2 .0 1 6) .研究结果表明 ,C.vinosum可溶性氢酶是一种新的催化放氢的 Ni Fe-氢酶 .

电位处理对棕色固氮菌整体细胞固氮活力的影响

用电化学综合测试仪调控电位,研究了棕色固氮菌整体细胞氧化还原性质。结果表明:电处理的菌体电位在-800 mV～+500 mV(相对于饱和甘汞电极电位)之内,菌体的固氮活力均高于未处理的细胞,其中在-400 mV 和-600 mV 处理的,其同氮活力分别增高78％和70％。用控电位法测定了棕色固氮菌整体细胞活性氧化还原电位为 E′_AOR=-645mV和E″_AOR=+566 mV。

钼酸盐柠檬酸盐络合物及有机酸对棕色固氮菌生长的影响

将经过0.9%NaCl溶液处理8h的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiOP)作为菌种分别接入Burk′s培养基和用不同有机酸替代柠檬酸三钠或用不同等摩尔的钼络合物替代钼酸钠的各种改良的Burk′s培养基中,分别测定菌体生长曲线和固氮活性.结果发现,与Burk′s培养基相比,以高柠檬酸、苹果酸、马来酸替代柠檬酸三钠或以K6[Mo2O5(cit)2]·5H2O、K4[Mo2O5(Hcit)2]·4H2O和Na2[MoO2(Hcit)]·3H2O替代柠檬酸三钠和钼酸钠的培养基能促进菌体的生长;以乙醇酸替代柠檬酸三钠的培养基则会抑制固氮菌的生长;各种培养条件下菌体细胞的C2H2还原活性表现了类似的规律.讨论了固氮酶活性中心FeMoco在装配过程中钼的可能运输方式和装配机理.