林烟草NsylCBL10启动子的克隆及功能分析

【目的】探究林烟草(Nicotiana sylvestris)类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因家族成员Nsyl CBL10的启动子在烟草不同生长发育过程及光信号刺激下的活性变化。【方法】克隆Nsyl CBL10启动子并初步预测其顺式作用元件;构建Nsyl CBL10启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并将其转入普通烟草(Nicotiana tabacum),获得转Nsyl CBL10pro::GUS的纯合材料;利用所获转基因材料探究Nsyl CBL10启动子在种子萌发期、幼苗期和成熟期的组织特异活性和在幼苗下胚轴的光诱导活性。【结果】预测结果表明,Nsyl CBL10启动子含有与组织特异性和响应光信号、植物激素和胁迫等相关的顺式作用元件;组织化学染色试验表明,Nsyl CBL10启动子驱动的GUS基因在种子萌发期主要在子叶节区-根过渡区、根尖表达,子叶伸展期主要在子叶、子叶节区-根过渡区和根尖表达,十字期主要在叶片中表达,成熟期在柱头、成熟的花药、侧根根尖和侧根根基部表达量较高;幼苗下胚轴中,Nsyl CBL10启动子驱动的GUS的基因表达在光下受到抑制,黑暗下被增强。【结论】Nsyl CBL10启动子活性在烟草不同发育期的组织中呈现动态变化。在烟草分生能力强的部位和成熟期的花器官中其启动活性较强,在幼苗下胚轴中的启动子活性受到光信号的调控。

林烟草NsylCBL10互作蛋白激酶NsylCIPK的鉴定与分析

植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK (CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步传导中发挥重要作用。CBL家族成员CBL10参与植物抵抗高盐胁迫、应对病菌侵染、参与分生组织和花器官发育、调节离子平衡等多个过程,对其下游互作CIPK家族成员的筛选与鉴定对于明确上述调节机制至关重要。为了鉴定林烟草(Nicotiana sylvestris) NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成员,本研究首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtCIPK家族成员和水稻(Oryza sativa) OsCIPK家族成员基因的CDS序列为检索序列,利用NCBI和中国烟草基因组数据库对林烟草中可能存在的NsylCIPK家族成员进行了预测;然后通过RT-PCR方法对预测到的NsylCIPK家族成员进行了克隆并利用生物学分析软件对其基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;最后通过酵母双杂交实验鉴定了与Nsyl CBL10互作的NsylCIPK家族成员。结果表明,在林烟草中可能存在28个NsylCIPK家族成员,实际克隆获得了20个NsylCIPK家族成员,在酵母双杂交体系中与NsylCBL10互作的只有1个NsylCIPK家族成员Nsyl CIPK14a。本研究为解析林烟草及其他物种中CBL-CIPK信号通路的调节功能提供了试验数据。

林烟草中与蛋白激酶NsylCIPK24a互作的NsylCBL蛋白家族成员的筛选鉴定

植物CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该家族成员通过与上游的CBL蛋白(Calcineurin B-like protein)互作,形成CBL-CIPK信号系统,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应过程。早期研究发现,拟南芥AtCIPK24分别通过与AtCBL4和AtCBL10互作,激活下游靶蛋白的活性,应对高盐胁迫。本研究前期从林烟草中获得了1个与拟南芥AtCIPK24同源的基因NsylCIPK24a,但与其互作的CBL家族成员及该激酶的具体功能尚不清楚。因此,本研究对林烟草CBL家族成员进行了全基因组预测;利用RT-PCR方法克隆CBL家族成员,并对其基因结构、蛋白保守结构域及组织表达情况进行了分析;通过酵母双杂交试验鉴定与NsylCIPK24a互作的林烟草CBL家族成员。结果表明,林烟草中共预测并克隆获得12个CBL家族成员;NsylCBL4、NsylCBL5、NsylCBL9和NsylCBL10 4个成员可与NsylCIPK24a在酵母中产生互作。推测烟草中可能也存在与拟南芥类似的应对盐胁迫的CBL-CIPK响应路径。本研究为解析林烟草NsylCIPK24a的功能、加深人们对烟草中CBL-CIPK调控通路的理解提供了研究数据。