流式细胞术分析冻存前后脐血CD34^+细胞的分布

目的 :探讨低温冻存对脐血CD34+ 细胞的影响。方法 :采用流式细胞仪分析冻存前后脐血CD34+细胞百分率、CD4 5 + 细胞和CD34+ 细胞的荧光强度变化及死细胞群的分布情况。结果 :冻存后CD34+ 细胞占CD4 5 + 细胞的百分率 [(0 .84± 0 .39) % ]明显高于冷冻前 [(0 .5 1± 0 .2 4 ) % ](P <0 .0 1) ,冻存前后CD34+ 细胞绝对数无明显变化 [(9.372± 6 .0 72 )× 10 6/L和 (9.2 4 6± 6 .132 )× 10 6/L](P >0 .0 5 ) ,冻存前后CD34+ 细胞百分率呈正直线相关 (r =0 .5 6 4 ,P <0 .0 1)。冻存后CD4 5 + 细胞荧光强度减弱 (P <0 .0 1) ,CD34+ 细胞荧光强度无明显变化 (P >0 .0 5 ) ;中性粒细胞比例下降 ,淋巴细胞和单核细胞比例增高。死细胞组分中以中性粒细胞为主 ,占 81.5 2 % ;活细胞组分中以淋巴细胞为主 ,占 5 9.4 4 %。结论 :冻存后CD34+ 细胞占CD4 5 + 细胞的百分率增高 ,但低温冻存对CD34+ 细胞绝对数量影响不大。死细胞主要为较成熟的粒细胞 ,冻存后CD34+ 细胞的分析需排除死细胞的干扰。

标准化脐血筛选方法在脐血库中的应用

目的对广州脐血库脐血筛选结果进行回顾性分析,建立脐血筛选的标准化方法和探讨其在脐血库建立中的意义。方法对脐血供者从产妇或其旁系亲属医学病史到新生儿随访实行四步筛选程序,筛选内容包括遗传、血液病等病史、脐血采集量、总有核细胞数、细胞活率、凝块和病原学感染等。结果1998年6月至2004年12月共分娩27404例、采集脐血8350份,占总分娩量比率为30.47%。合格4085份,合格率为48.92%;废弃脐血4265份(占51.08%),废弃的主要原因依次为脐血采集量<60ml、血凝块、总有核细胞数、活率低。检疫期共废弃脐血46份(占1.11%);其中检出细菌阳性19例(占41.30%),巨细胞病毒抗体(CMV-lgM)阳性20例(占43.48%)。新生儿随访共发现15例异常,占0.37%。4085份脐血总有核细胞数平均为1.21×109,根据脐血有核细胞输入量3.7×107/kg体重计算,平均能适合32.7kg的受者移植;而按2.0×107/kg体重计算平均能适合60.5kg的受者移植。104例脐血移植中72例获得植入(69.2%)。结论脐血供者的标准化筛选方法可以排除可能存在的血液性、遗传性和传染性等疾病,确保移植用脐血的安全;并能为脐血库的建立节约采集、处理、冻存等费用,提高库存脐血的有效利用率。

二甲基亚砜和右旋糖酐对脐血造血细胞的低温保护作用

目的 :探讨液氮保存中联合低温保护剂二甲基亚砜和右旋糖酐对造血细胞的保护作用和不同冻存时间对造血细胞活力的影响。方法 :通过测定冻存前后总有核细胞数 (TNC)、细胞活率、造血祖细胞集落生成情况 ,反映冻存后造血细胞损失情况及增殖能力。结果 :40例脐血冻存后细胞活率平均为 91.5 % ,TNC、粒 -巨噬细胞集落形成单位、红系爆增式集落形成单位、混合集落生成单位平均回收率分别为 95 .0 %、86 .7%、81.8%、84.4%。不同保存时间细胞活率 ,TNC、祖细胞回收率差异均无显著性意义 (P>0 .0 5 )。结论 :联合保护剂对造血细胞有良好保护作用 ,适合于建立脐血库长期低温保存造血细胞。长期冻存造血细胞的效果与冻存时间无密切关系。

脐血采集方式对脐血造血细胞含量的影响

目的比较阴道分娩和剖宫产采集脐血所含造血细胞含量的差异,评估两种采集方式的优缺点。方法回顾性分析两种脐血采集方式间新生儿体重、采集体积、总有核细胞数(TNC)、CD34+细胞百分率、CD34+细胞数和总集落数(CFUs)的差异。结果采集体积在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。而阴道分娩组TNC、CD34+细胞百分率、总CD34+细胞数、CFUs数明显高于剖宫产组,新生儿体重小于剖宫产组,差异有统计学意义(P<0.05)。新生儿体重在2.5kg～4.0kg时,阴道分娩组TNC、总CD34+细胞数和CFUs数明显高于剖宫产组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阴道分娩采集方式采集的脐血含有较高的造血细胞含量且有利于采集到更好脐血质量,可作为同胞脐血移植采集脐血的最优选分娩和采集方式。

二甲基亚砜和右旋糖酐应用于脐血造血细胞的低温保存

探讨液氮保存中联合低温保护剂 (二甲基亚砜和右旋糖酐 )对造血细胞的保护作用和不同冻存时间对造血细胞活力的影响。同时分析脐血全血 4℃保存造血细胞的变化。通过测定冻存前后总有核细胞数 ( TNC)、细胞活率、造血祖细胞集落生成情况 ,反映冻存后造血细胞损失情况及增殖能力。结果显示 40例脐血冻存后细胞活率平均为 91 .5 % ,TNC、CFU- GM、BFU- E、CFU- GEMM平均回收率为 95 .0 %、86 .7%、81 .8%、84.4%。不同保存时间细胞仍保持较高细胞活率和祖细胞产率 ,48小时细胞活率和祖细胞产率有明显下降。二甲基亚砜 ( DMSO)与右旋糖酐 ( Dextran)组成的联合保护剂对造血细胞有良好保护作用 ,适用于造血细胞的长期低温保存。长期冻存造血细胞的效果与冻存时间无密切关系。全血 4℃保存应在 2 4小时分离冻存。

重型β-地中海贫血患儿同胞脐血移植后造血与免疫重建分析

目的:分析重型β地中海贫血患者同胞脐血移植后的造血和免疫重建情况,评价同胞脐血移植治疗重型β地中海贫血效果。方法:2例患者移植后均为稳定骨髓植入,分别于移植后1,3,6,9 个月检测患者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD19+ )和NK细胞(CD56+ )数量,动态分析脐血移植后患者的免疫重建。结果:2例患者移植后中性粒细胞绝对计数≥0.5×109/L的时间分别为第21天和第12天,血小板计数≥50.0×109/L的时间分别为第53天和第39天,血常规恢复正常时间分别为第71 天和第59天。T细胞亚群在6个月内均恢复正常;B细胞和NK细胞在3个月内均恢复正常。CD4+/CD8+ 比值恢复正常的时间分别为3个月和9个月。B细胞和NK细胞的恢复比T细胞快。2例患者均发生急性Ⅰ度移植物抗宿主病。结论:同胞脐血移植后患者免疫重建快且稳定,急性移植物抗宿主病程度轻。同胞脐血移植是根治重型β地中海贫血的有效方法。

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Percoll分离液(1.073g/ml)从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系(地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L)及脂肪诱导体系(地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L)分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定。结果表明:从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45。定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴。结论:采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定。本操作方案具有一定的临床应用价值。

广州地区高龄孕妇孕中期唐氏综合征筛查与产前诊断结果分析

目的探讨广州地区高龄孕妇（产龄不低于35岁）进行孕中期唐氏综合征筛查的必要性及其在产前诊断中的意义。方法对本院107 277例孕14-20周＋6天之孕妇进行三联血清学筛查,通过Lifecycle3.2风险评估软件计算罹患唐氏综合征的风险率,以1/270作为风险截断值,对高风险孕妇建议进行产前诊断,随访其妊娠结局。同时以低龄孕妇作为对照进行比较。结果在107 277例受检孕妇中,筛查出高风险孕妇7 147例,筛查阳性率为6.39%,其中高龄孕妇1 564例,筛查阳性率为22.68%;低龄孕妇5 583例,筛查阳性率为5.55%。最终检出21-三体综合征35例、18-三体综合征7例、其他染色体异常46例。结论对高龄孕妇行唐氏综合征血清学筛查,检出率高于低龄孕妇,再根据筛查结果进行产前诊断,可有效减少介入性诊断手术,减轻孕妇紧张情绪。

HLA-DRB1高分辨测序分型与48例非亲缘性脐血移植者GVHD相关性分析

1998年6月至2003年7月,广州脐血库向国内21家移植中心提供非亲缘异基因脐血移植54例。本研究采用PCR产物直接测序法对HLA-DRB1进行高分辨分型(PCR-sequencing based typing PCR-SBT),并结合HLA-SSP低分辨分型结果,探讨非亲缘性脐血移植供/受者HLA-DRB1等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系。利用盐析或柱提法提取48例非亲缘性脐血及移植患者全血DNA,采用HLA-SBT方法分别对HLA-DRB1等位基因进行高分辨分型,并与HLA-SSP(HLA-sequencing specific primers)低分辨结果进行比较分析。结果表明:采用双盲法对48例非亲缘性脐血移植供/受者样本HLA-DRB1进行高分辨分型,结果HLA-DRB1等位基因亚型匹配全相合病例的GVHD发生率(25%)显著低于不完全相合病例的GVHD发生率(65.6%)(P=0.008)。结论:对HLA-DRB1采用高分辨分型方法在非亲缘性脐血移植HLA分型方面具有重要的临床应用价值。

脐血库脐血的采集和废弃标准评价

目的 评价有关脐血的采集和废弃标准。方法 参照美国纽约脐血库的标准 ,建立了新的脐血采集和废弃标准 ,对 42 70例脐血进行筛选。结果 共采集了 90 5份 (剔除的脐血以合并HBV感染的为主 ) ,符合入库标准的脐血有 52 8份 (脐血体积 <6 0ml为主要剔除原因 ) ,占年分娩率的 1 2 4% ,占总采集量的 58 3%。结论 建立脐血库的首要问题就是有严格的采集和废弃标准 ,这是保证脐血质量的前提 ,也是脐血库赖以生存和发展的基础。

多份脐血移植13例回顾性分析

为了探索成人多份脐血移植的可行性 ,对广州市脐血库 1998年 6月至 2 0 0 3年 7月提供的 13例非亲缘关系多份脐血移植进行回顾性分析。脐血均采自广州市妇婴医院正常分娩的足月顺产孕妇 ,脐血分离、冻存、复温方法参照纽约脐血库标准及相关文献 ;多份移植脐血HLA匹配为 1 6 - 2 6位点不相合。结果表明 :1998年 6月至2 0 0 3年 7月 ,广州市脐血库向国内 7家移植中心提供非亲缘关系脐血 2 8份 ,治疗患者 13例。受者中位年龄 2 2 (8- 4 1)岁 ,中位体重 5 0 (2 1- 75 )公斤 ,2 8份脐血中TNC总输入量中位数为 2 .91× 10 7 kg。13例中 6例植入 (中性粒细胞 >5× 10 8 L) ,植入率为 4 6 .1% ,植入平均时间为 19天。 1例患者发生GVHD反应 ,1例患者发生自体恢复。生存率 4 6 .2 % (6 13)。结论 :多份脐血移植具有良好的应用前景。

54例非亲缘脐血造血干细胞移植回顾性分析

本研究对广州市脐血库1998年6月至2003年7月提供的54例非亲缘脐血移植进行回顾性分析,以研究 脐血移植的相关影响因素。脐血均采自广州市妇婴医院正常分娩的足月顺产孕妇,脐血分离、冻存、复温方法参照 纽约脐血库标准及相关文献;选择脐血的依据是HLA相合程度及有核细胞数量。结果表明:1998年6月至2003 年7月间,库存脐血3475份,与21家移植中心合作提供脐血99份,治疗患者85例。其中同胞脐血移植11例。时 54例非亲缘关系脐血移植病例进行统计分析显示,在54例受者中,恶性病患者43例,占79.6％,非恶性病患者11 例,占20.4％,受者中位年龄9.5(1.2-33)岁,中位体重27(10-60)公斤,TNC中位输入量6.82×107／k异,移植后 60天植入43例(ANC>500／μl的中位时间为17天),植入率为79.6％。脐血移植有核细胞重建时间与输入的有 核细胞数以及疾病类型相关,同HLA相合程度不相关。急性Ⅲ-Ⅳ度GVHD发生率为21.6％,慢性GVHD发生率 为5.4％。6例患者出现自体恢复(11.1％)。存活率42.6％。结论:非亲缘性脐血造血干细胞移植尤其在治疗小 儿白血病方面具有良好的应用前景。

脐血中CD34^+CD38^+细胞含量对急性白血病患者移植后造血重建的影响

为了探讨非亲缘脐血移植中CD34+ CD38+ 细胞回输量对造血重建的影响 ,采用流式细胞术分析复苏后的CD34+ CD38+ 细胞数 ,并对 2 0例急性白血病患者的体重、中性粒细胞 (ANC)和血小板 (Plt)恢复时间进行测定。结果表明 :2 0例接受的CD34+ CD38+ 细胞输入量为 (9.85 - 32 5 .71)× 10 4/kg ,其ANC恢复 >5× 10 8/L的中位时间为 18 5 (11- 32 )天。在 19例患者中Plt恢复 >2× 10 10 /L的中位时间为 4 5 (12 - 118)天。CD34+ CD38+ 细胞输入量与ANC和Plt恢复时间存在相关 ,r值分别为 - 0 .5 77(P <0 .0 1)和 - 0 .5 0 3(P <0 0 5 )。结论 :CD34+ CD38+细胞含量与造血恢复时间相关 ,足量输入CD34+ CD38+

广州脐血库3605脐血供者6个月后随访

本研究回顾分析了脐血库对库存3 605份脐血所进行的脐血供者6个月后的随访情况,探讨供者随访制 度在脐血库运作过程中的作用。1998年6月至2004年2月间,通过电话、信函方式对捐献脐血满6个月的母亲进 行了母婴健康调查随访,对脐血的质量作出了评估。结果表明:有3 195人接受了电话随访,18人婉拒。对于无法 通过电话随访的,则采用信函调查形式,共发信392封,回信15封。电话随访每例平均耗时12分钟。随访资料显 示婴儿染色体异常2例、先天性甲状腺功能低下1例、粒细胞减少症1例、白化病1例、不明原因死亡5例。所有这 些被查明为非正常婴儿供者的脐血均被废弃。总之:脐血库进行脐血供者6个月后的随访工作,能有效地提高库 存脐血的质量。

冷冻对脐血CD_(34)^+细胞上粘附分子表达的影响

目的 通过了解冷冻后脐血CD3 4 + 细胞上粘附分子表达的变化 ,评价脐血的冻存和不同输注脐血的方法对脐血移植造血恢复可能造成的影响。方法 取 15份经羟乙基淀粉分离的脐血各 2ml,保存在液氮中 6～ 8月后 ,检测新鲜标本、冻存标本复温后及短暂孵育后白细胞和CD3 4 + 细胞的变化 ,以及CD3 4 + 细胞表达CD62 L、CD2 9、CD49d、CD11b、CD44和CXCR4情况的变化。结果 冻存前后白细胞和CD3 4 + 细胞含量无明显变化。而CD62 L和CXCR4表达量在冻存后明显减少 (分别由 3.2 2 8× 10 4和 2 .931× 10 4下降到 2 .2 2 0× 10 4和 1.2 87× 10 4,P <0 .0 5 ) ,其他粘附分子无明显变化。在 37℃孵育 30min后 ,CD62 L和CXCR4表达量又快速地恢复。结论 冻存对造血细胞的数量无明显影响 ,对粘附分子表达的影响也是一过性的 ,尚未观察到对移植患者的造血恢复有明显影响。由于复苏后CD3 4 + 细胞的CD62 L和CXCR4表达有明显的波动 ,在脐血移植时 ,将脐血洗去冷冻保护液并短暂孵育后再输注比复苏后不经任何处理直接输注 ,可能更有利于患者的造血恢复。

不同保存温度对脐血造血细胞的影响

目的 :探讨液氮的液相和气相保存条件对脐血造血细胞的影响。方法 :对 15例分离后的脐血有核细胞进行程控降温 ,分别保存于液相 (- 196℃ )和气相 (- 12 5～ - 15 0℃ )中 ,在 0 .5～ 1.0年后复温 ,对脐血造血细胞的活率、有核细胞回收率和祖细胞数进行了比较。结果 :在液相中保存半年和 1年的细胞活率、有核细胞数及总祖细胞数的回收率无明显变化 ;在气相中保存 0 .5～ 1.0年的细胞活率、有核细胞数及祖细胞数的回收率差异较明显。结论 :为避免脐血造血细胞在长期冻存过程中的损失 。

HLA测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨

1998年6月至2004年7月,广州脐血库向国内21家移植中心54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探讨非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系,对54例非亲缘性脐血移植病例中,半年后有反馈随访资料的48例,利用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA,采用HLA-SBT方法分别对HLA-A、B、DRB1位点进行了高分辨分型,并与我库脐血收集常规采用的HLA-SSP(HLA-Sequencingspecificprimers)低分辨结果进行了比较分析。结果发现,HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的发生率具有统计学显著性差异(P<0.05)。在对HLA-A、B、DRB1等位基因高分辨单因素分型结果中,HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD发生率显著低于不完全相合病例GVHD的发生率(P=0.000,P=0.005)。结论:PCR-SBT技术在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有重要的临床应用价值。

CD_(34)^+CD_(49d)^+细胞输入量对儿童急性白血病无关脐血移植的影响

目的 :研究CD3 4 + CD49d+ 细胞输入量在无关脐血移植治疗儿童急性白血病中对造血干细胞植入、中性粒细胞恢复时间的影响。方法 :用流式细胞术分析复苏后的CD3 4 + CD49d+ 细胞数 ,并对 17例儿童急性白血病在无关脐血移植后的中性粒细胞恢复时间进行分析。结果 :移植后 17例患者中性粒细胞 >0 .5× 10 9/L的时间为 11～ 32d(中位数为 17d)。CD3 4 + CD49d+ 细胞输入量为 (10 .2 0～ 5 2 7.4 1)× 10 4/kg(中位数为 12 0 .0 1× 10 4/kg)。中性粒细胞恢复时间与CD3 4 + CD49d+ 细胞输入量呈负相关 (γ =- 0 .6 31,P <0 .0 5 )。结论 :无关脐血移植的CD3 4 + CD49d+ 细胞输入量与造血干细胞的植入和造血重建有关。

CD11b对儿童急性白血病脐血移植粒细胞和血小板恢复时间的影响

为了研究CD34+ CD1 1b+ 细胞输入量在脐血移植中对中性粒细胞和血小板恢复时间的影响 ,观察并分析 1 7例儿童急性白血病患者进行无关脐血移植的临床数据。结果显示 ,移植后 1 7例患者中性粒细胞≥ 0 5× 1 0 9 L的时间为 1 1～ 32天 (中位数为 1 7天 ) ;血小板≥ 2 0× 1 0 9 L的时间为 1 2～ 1 1 8天 (中位数为 4 0天 )。CD34+CD1 1b+ 细胞输入量为 1 0 7～ 79 0 0× 1 0 4 Kg(中位数为 9 1 8× 1 0 4 Kg)。CD34+CD1 1b+ 细胞输入量与中性粒细胞恢复时间呈反比 (γ =- 0 4 89,P <0 0 5) ;CD34+CD1 1b+ 细胞输入量与血小板恢复时间无关 (r =- 0 2 38,P >0 0 5)。CD34+ CD1 1b+细胞输入量与造血干细胞移植时的造血重建有关。