利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因定点突变细胞株

肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失;qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比,2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用奠定了基础。

去乙酰化酶3对线粒体功能和猪生长发育影响的研究进展

去乙酰化酶3(Sirt3)是去乙酰化酶家族的一员,具有高度的去乙酰基酶活性,对动物体的生长发育、衰老、代谢等生理过程具有调控作用。目前的研究表明,Sirt3可以激活超氧化物歧化酶、调控三羧酸循环和促进电子传递链3个途径,消除细胞内的活性氧(ROS),避免细胞的氧化损伤和线粒体膜电位的损伤,进而影响细胞凋亡与自噬;并可通过调控ROS、降低各种退行性疾病的发病率等途径减缓衰老。同时,Sirt3通过激活AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)等途径影响肌肉的发育。对猪的研究表明,不同Sirt3突变型猪的肌肉色值和失水率等肉质指标存在差异,且Sirt3对脂肪酸氧化和酮体生成有一定的影响。在对与猪Sirt3蛋白有较高同源性的牛进行的研究中发现,不同Sirt3突变型的牛体长、体高、肌肉脂肪含量等指标存在显著差异。作者总结了Sirt3对线粒体的能量代谢和细胞氧化损伤的调控机制及其对细胞凋亡、细胞自噬和机体衰老的影响,阐述了猪Sirt3蛋白的部分理化性质及其对猪生长发育的作用机制,以期为了解和挖掘该基因在猪肌肉和脂肪发育中的生物学作用,以及家畜生产性状改良提供理论依据。

1例羊感染猪链球菌的诊断

猪链球菌病为急性败血性链球菌病,是由猪链球菌引起的感染性强、病死率高的一种热性传染病。猪链球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰阳性菌,也是一种人兽共患病病原[1]。

利用CRISPR/Cas9系统构建猪PLIN1基因敲除载体及其效率检测

围脂滴蛋白(PLIN1)是具有抑制基础脂解,调节脂肪甘油三酯的储存和水解的蛋白。本试验利用CRISPR/Cas9系统设计了3条能够靶向切割PLIN 1基因的sgRNA并构建相应的突变载体。将构建好的质粒转染入PK15细胞,利用嘌呤霉素筛选,富集PLIN 1突变细胞,提取各组细胞DNA进行PCR扩增突变区域,通过序列测定在DNA水平确定突变效率。提取各组细胞总RNA及蛋白,分别利用qRT-PCR及Western Blot测定PLIN1 RNA水平和蛋白水平的表达量。结果表明,各组细胞PLIN 1 DNA均检测到突变或缺失,PLIN1-KO1、PLIN1-KO2和PLIN1-KO3突变比率分别为8%、30%和18%,且mRNA及蛋白表达量均有下降,其中PLIN1-KO2突变效率最高,RNA和蛋白表达量与正常组细胞相比分别下降78.26%和74.00%,差异均极显著(P<0.01)。本试验成功构建了PLIN 1基因敲除载体,其中PLIN1-KO2载体突变效率最高,为后续研究PLIN 1基因对猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用提供科学依据。

脂滴包被蛋白基因对猪肌肉发育的影响

PLIN(perilipin,脂滴包被蛋白)是脂滴表面含量最多的一种蛋白,被认为是影响猪生长、胴体及肉质性状的重要候选基因。PLIN基因几乎在所有组织中均有广泛表达,对脂肪组织中甘油三酯的分解和储存具有重要的双重调控作用,主要调控类固醇激素合成前体、胆固醇酯的分解;通过调节脂肪酶的功能和脂肪沉积来影响肌肉的生长发育并能影响高氧化能力组织内的线粒体功能。本文综述了猪PLIN基因背景、基因结构及组织分布情况,并对近年来PLIN基因对猪肌肉发育影响的研究进行了总结,解析其在骨骼肌发育差异调控网络中的地位和作用,为家猪生产性状改良提供理论依据。

不同类型猪肌肉组织中代谢及线粒体功能相关蛋白分析

为了研究影响家猪体型、肉质发育差异的因素,采用Western blot方法检测巴马猪、大白猪和姜曲海猪3种不同类型猪骨骼肌肌肉组织中线粒体功能相关蛋白细胞色素C氧化酶调节亚基4蛋白(COX4)、视神经萎缩症蛋白1(OPA1)、动力相关蛋白1(DRP1)、解偶联蛋白2(UCP2)以及与能量代谢相关蛋白B淋巴细胞瘤2蛋白(Bcl-2)、帕金森蛋白(Parkin)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)的差异。结果显示:在线粒体相关蛋白比较检测中,4个蛋白均在大白猪中表达量最高,其次是巴马猪,在姜曲海猪中表达量最低,3组间差异均极显著(P<0.01);在能量代谢相关蛋白的比较检测中,Bcl-2/BAX蛋白表达量的比值在姜曲海猪(P<0.01)和大白猪(P<0.05)肌肉组织中极显著或显著高于巴马猪,Parkin蛋白在瘦肉型猪巴马猪和大白猪中均极显著高于脂肪型姜曲海猪(P<0.01)。综上,上述与促进或者稳定线粒体功能有关的蛋白均可能和促进猪肌肉生成,减少脂肪生成有关。