基于单细胞荧光成像技术的昼夜节律监测分析

昼夜节律作为机体的无形时钟精密调控多种生理功能,包括睡眠、觉醒、大脑认知、免疫力等。下丘脑视交叉神经上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)作为昼夜节律系统的主起搏器,能够自主产生节律性输出信号,协调维持全身多个组织、器官的时钟变化。同时,SCN通过神经元间的耦合作用,实现不同神经细胞节律性变化的步调一致性,产生强劲的振荡性规律,以维持机体内部节律稳定、抵抗外界环境因素干扰。为直观的研究SCN区在机体昼夜节律中的功能,实现单细胞尺度观测SCN神经元节律性变化,本研究搭建了单细胞荧光成像系统,通过深度制冷CCD相机,利用荧光素酶报告基因系统,对体外分离培养的SCN脑片进行长周期实时成像,原位观察SCN区不同细胞节律基因的振荡性表达规律。利用Eviews、IgorPro等软件,对荧光强度在单细胞尺度及时间尺度上进行量化分析,最终实现了在单细胞水平监测观察节律基因的振荡性变化。利用河豚毒素(TTX)能够可逆性的破坏SCN细胞间的耦合作用,验证了该系统的可行性。综上,本研究成功搭建了基于荧光素酶报告基因系统的单细胞实时荧光成像平台及分析技术,实现了对SCN神经元基因表达节律性变化的实时监测。

囊泡运输蛋白SNAP23对肿瘤细胞有丝分裂的调控作用

目的研究囊泡运输蛋白SNAP23对肿瘤细胞有丝分裂的调控作用,为基于其细胞周期调控的抗肿瘤治疗策略提供理论基础。方法在HEK293T细胞中过表达细胞周期重要激酶CDK1的激活形式或灭活形式,检测二者是否会使SNAP23发生磷酸化修饰,并在肿瘤细胞中用两条不同序列的siRNA敲低SNAP23,采用Time lapse活细胞成像技术检测敲低SNAP23对有丝分裂期进程的影响,利用TCGA数据库分析SNAP23在肿瘤和癌旁组织的表达差异。结果 SNAP23能被激活形式的CDK1激酶复合体磷酸化,而不能被灭活形式的CDK1激酶复合体磷酸化;与对照敲低组比较,在肿瘤细胞中敲低SNAP23(SNAP23敲低组)可引起细胞有丝分裂的明显阻滞(P<0.01),其有丝分裂的前中期时间显著延长(P<0.01);TCGA数据库分析表明,与癌旁组织相比,SNAP23的mRNA表达量在胆管癌中明显升高(P<0.01)。结论囊泡运输蛋白SNAP23能被有丝分裂期重要激酶CDK1激酶复合体磷酸化,并调控肿瘤细胞的有丝分裂期进程。结合数据库分析,提示SNAP23的异常表达可能通过调控肿瘤细胞的细胞周期参与肿瘤的发生发展。