慢病毒介导KSHV vIL-6基因稳定表达的血管内皮细胞株的建立

目的建立慢病毒介导且稳定表达病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)蛋白的血管内皮细胞株。方法以质粒pvIL-6-Flag为模板,PCR扩增vIL-6基因,克隆至慢病毒载体p3DLV,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,构建含vIL-6基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,经潮霉素筛选,获得稳定表达细胞株,western blot鉴定vIL-6蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为615 bp的vIL-6基因成功克隆至慢病毒表达载体;重组慢病毒经包装、纯化后测得滴度为1.0×107 TU/mL。重组慢病毒感染EA.hy926细胞,经潮霉素筛选,形成生长形态良好的单克隆细胞株EA.hy926-vIL-6。western blot鉴定该细胞株可稳定表达vIL-6蛋白。结论建立了稳定表达vIL-6的EA.hy926细胞株,为进一步研究vIL-6的生物学功能及致病机制提供了细胞模型。

成果为导向教育模式在临床微生物检验技术教学中的应用研究

临床微生物学检验技术是医学检验专业重要的基础课程之一,该文以成果导向教育(OBE)理念为指导,通过分析目前临床微生物学检验技术教学现状,对教学内容和方法提出改进措施,以期达到更好的教学效果。实践表明,OBE教育模式提高了学生的专业认可度、课堂参与度和解决实际问题的能力,符合检验医学的行业需求,为微生物检验技术教学改革提供了新思路。

以引导学生自主学习为核心的医学检验导论课程建设探讨

医学检验专业新生入学时常由于缺乏对专业的了解和认可,学习目标不明确,缺乏学习兴趣,被动学习。开设医学检验导论课程,有助于稳定学生专业思想,明确学习目标,激发学习热情,指导学生合理规划学习和人生道路。在导论课建设中,要坚持以引导学生自主学习为核心,激发学习意愿,培养学习能力,提高教学质量。

甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。

手术患者耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌血流感染预后不良的危险因素分析

目的 分析手术患者发生耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)血流感染的临床特征及预后不良的危险因素,为临床早期诊断及感染控制提供依据。方法 回顾性分析2017—2020年南京医科大学第一附属医院183例CRKP血流感染患者临床资料及实验室检查,根据血流感染发生前是否有手术史分为手术组(115例)和非手术组(68例),分析手术组患者治疗28 d后的预后影响因素。结果 183例CRKP血流感染患者中62.8%存在手术史,手术组患者在引流管留置和住院时间≥28 d比例均高于非手术组。入住ICU和感染性休克是影响手术组患者预后的独立危险因素。结论 CRKP血流感染患者中手术组人数高于非手术组,入住ICU和感染性休克可显著增加手术患者CRKP血流感染死亡风险,临床医师应积极给予预防和及时诊治措施。

PBL联合CDIO教学模式在临床微生物检验实践教学中的应用

临床微生物检验是医学检验重要的专业学科之一,主要研究临床常见病原微生物的生物学性状、病原学诊断及治疗等,与临床诊疗密切相关。临床微生物检验实践实习期作为医学检验学生走向工作岗位的过渡,是其提升临床技能、拓展思维能力的关键阶段,因此,临床微生物检验实践教学的意义重大。文章结合目前临床微生物检验实践教学现状及新形势下的医学人才培养目标,探讨以问题为基础的教学(problem-based learning,PBL)联合构思-设计-实施-运作(conceive-designimplement-operate,CDIO)教学模式的应用,以期达到更好的教学效果。实践表明,PBL联合CDIO教学模式在培养学生自主学习能力、临床思维及创新思维能力方面具有优势,对于临床微生物检验实践教学质量的提高有着积极的意义。

多主棒孢菌致真菌性角膜溃疡1例并文献复习

目的报道1例多主棒孢菌引起的真菌性角膜溃疡病例并复习相关文献,提高临床对该菌引起感染性疾病的认识。方法回顾性分析1例多主棒孢菌致真菌性角膜溃疡病例资料,并以英文关键词“Corynespora cassiicola”、中文关键词“棒孢菌”和“棒孢霉”为检索词,检索PubMed、中国知网、万方和维普数据库等国内外报道的病例,结合文献综合分析多主棒孢菌临床感染的特点。结果该例患者临床表现和实验室检查符合真菌性角膜溃疡的临床特征,病变角膜组织培养提示多主棒孢菌生长,经右眼角膜移植术及抗真菌治疗后好转。复习文献并结合该例,共12例多主棒孢菌临床感染病例。除1例病例资料不完整外,其余11例中男8例,女3例,年龄8~84岁。患者多存在基础疾病,包括糖尿病2例、慢性阻塞性肺疾病1例、高血压1例、慢性阻塞性肺疾病合并高血压1例;感染危险因素包括胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)基因突变3例、植物暴露4例(3例农民、1例眼外伤)、长期使用激素2例、侵袭性诊疗操作1例;11例均引起暗色丝孢霉病,感染部位包括皮下感染7例、眼部感染3例、中枢神经系统感染1例,临床表现主要与受累组织系统相关;临床治疗中两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬是最常用的抗菌药物,联合外科手术治疗者3例;临床转归中9例患者好转,2例患者无明显改善。结论多主棒孢菌引起的临床感染罕见,以皮下暗色丝孢霉病为主,眼部感染次之。对于存在基础疾病或免疫功能缺陷,并有植物暴露史的患者,临床应提高警惕。临床以抗真菌治疗为主,外科手术可作为快速清除病原体的重要治疗手段。该菌感染总体预后良好。

血浆DNA甲基化检测在宫颈疾病诊断中的应用

目的对宫颈疾病患者血浆APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平进行定量检测,探讨其在宫颈疾病诊断中的意义。方法收集34例宫颈低度病变(CINⅠ期)、43例宫颈高度病变(包含CINⅡ、CINⅢ期)、41例宫颈癌患者治疗前血浆及25例健康妇女血浆。另收集31例与血浆对应的宫颈组织标本。用双重实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)技术检测APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平并进行统计学分析。结果宫颈疾病患者血浆中APC和RASSF1A甲基化水平与肿瘤组织有较好的一致性,且肿瘤组织水平高于血浆水平(Z分别为-2.236和-3.228,P均<0.05)。宫颈癌组血浆APC与RASSF1A甲基化率均高于低度病变组(P均<0.05);宫颈高度病变组血浆RASSF1A甲基化率也高于低度病变组,差异有显著性(P<0.05)。血浆APC和RASSF1A甲基化阳性结果在低度病变组、高度病变组和宫颈癌组均无显著性差异(P>0.05)。结论血浆DNA甲基化水平能反映宫颈癌的发生、发展变化,在宫颈癌的早期诊断中可能有重要价值。

南京医科大学第一附属医院2014年临床常见革兰阴性菌分布及耐药分析

目的分析南京医科大学第一附属医院2014年临床分离革兰阴性菌的分布及其对常用抗菌药物的耐药性。方法细菌鉴定采用API系统或VITEK-2 Compact自动鉴定仪;细菌药物敏感试验采用纸片扩散法(K-B法)或稀释法;数据统计分析用WHONET 5.6软件。结果 2014年共分离出各类细菌共7 931株,其中革兰阴性菌5 088株,占64.2%,排名前3位的是大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌。共分离耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌195株,占肠杆菌科的6.9%;多重耐药鲍曼不动杆菌613株,占鲍曼不动杆菌的66.5%;多重耐药铜绿假单胞菌197株,占铜绿假单胞菌的28.7%。结论 2014年该院革兰阴性菌耐药主要为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌、多重耐药鲍曼不动杆菌和多重耐药铜绿假单胞菌,进行细菌耐药监测有利于指导临床合理用药。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌血流感染死亡患者临床特征及危险因素分析

目的分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)血流感染患者临床特征及预后危险因素,为控制和预防MRSA血流感染提供依据。方法回顾性分析2015年1月—2020年12月南京医科大学第一附属医院门诊及住院血液培养MRSA阳性患者临床特征和预后危险因素。结果142例MRSA血流感染患者以男性、老年为主,生存99例,死亡43例,死亡率为30.3%。死亡组血清降钙素原(PCT)值显著高于生存组,1.08μg/L为诊断界值。合并感染性休克和合并呼吸系统感染是患者死亡的独立危险因素。结论合并感染性休克和合并呼吸系统感染均是患者预后的独立危险因素,血清PCT值对预测MRSA血流感染患者预后有一定临床应用价值。

质谱直接鉴定血培养阳性菌的前处理方法评估

目的:评估基于分离胶的两种前处理方法联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)直接鉴定血培养阳性病原菌的临床应用价值。方法:收集2020年5—11月南京医科大学第一附属医院血培养阳性标本302例,分离胶-皂甙法和分离胶沉淀法分别处理后对阳性血培养标本进行快速鉴定,结果分别与培养鉴定结果比较。结果:分离胶-皂甙法可在45 min内完成鉴定,分离胶沉淀法需20 min;单数菌感染标本288例,使用两方法直接鉴定的准确率均为86.81%(250/288),其中两方法分别鉴定革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、真菌的准确率差异无统计学意义(P>0.05);复数菌感染标本14例,仅分离胶-皂甙法1例与培养鉴定结果一致,其余标本两种方法均仅可准确鉴定其中的一种细菌。结论:两种基于分离胶的前处理方法联合质谱均可直接、快速、准确地鉴定血培养病原菌,分离胶沉淀法可作为本实验室血培养快速鉴定常规的前处理方法。

虚实结合的新型教学模式在微生物检验实验教学中的应用

临床微生物检验技术是检验医学的重要课程,实验教学是学生实践微生物相关实验技术的基本环节。传统实验教学模式陈旧,实验内容单一,实验场地和课时严重影响了课堂效率和学生综合能力的培养。虚拟仿真教学能够建立仿真实验环节,模拟实验对象和内容,使学生在虚拟仿真实验中加深对实践操作知识的认知。虚实结合的新型教学模式既能培养学生实践操作能力,又能培养其解决问题和临床思维能力。

下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液定量培养及临床分析

目的:探讨下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液病原菌分布及对常用抗菌药物的耐药性,为临床用药提供合理依据。方法:回顾性分析南京医科大学第一附属医院2018年下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液定量分离培养结果及临床资料。结果:178例患者共分离病原菌197株,其中社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)101例(56.7%),医院获得性肺炎(hospital acquired pneumonia,HAP)77例(43.3%),主要来源于重症监护病房(30.5%)、老年医学科(29.5%)、呼吸与危重症医学科(26.4%)。HAP病原菌以革兰阴性菌为主,占89.5%,CAP病原菌也以革兰阴性菌为主,但比例低于HAP病原菌,占77.5%。分离到的病原菌中,革兰阴性菌163株,占82.7%,排在前3位的是鲍曼不动杆菌(71株,36.0%)、铜绿假单胞菌(34株,17.3%)和肺炎克雷伯菌(28株,14.2%);真菌21株,占10.7%,其中念珠菌属16株,曲霉菌4株,糠皮马拉色菌1株;革兰阳性菌13株,占6.6%,主要为金黄色葡萄球菌(10株,5.1%)。鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南耐药率均为98.6%,铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南耐药率分别为29.4%、23.5%,肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南耐药率均达57.1%。10株金黄色葡萄球共检出6株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌,检出率为60.0%,未检出对万古霉素、利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌。结论:支气管肺泡灌洗液常见致病菌为革兰阴性杆菌,各病原菌耐药情况严重。临床应严格按照药敏结果合理用药,降低多重耐药菌肺部感染的发生率。

实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因

目的建立艰难梭菌实时荧光定量PCR检测方法,直接检测粪便标本艰难梭菌tcd B基因,并探讨其应用价值。方法根据艰难梭菌基因组设计tcd B基因特异性引物及探针,用ATCC 43255标准株评价其敏感性,选取艰难梭菌生物学特征相近的临床菌株验证其特异性;收集2015年10-12月临床腹泻患者稀便标本115份,提取基因组总DNA后进行tcd B基因检测,并以产毒培养法为参考方法,探讨该方法的临床诊断价值。结果荧光定量PCR法最低检测限为1×10-3ng,并且仅特异性地扩增产毒艰难梭菌;临床样本评价荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。结论实时荧光定量PCR直接检测稀便标本中的艰难梭菌tcd B基因可用于艰难梭菌相关腹泻的快速诊断。

单抗NJ001杀伤肺腺癌细胞机制的初步研究

目的:观察单克隆抗体NJ001杀伤肺腺癌细胞的活性,并探索其分子机制。方法:选择肺腺癌细胞株SPC-A1作为研究对象,流式细胞仪检测细胞凋亡率;相差显微镜观察凋亡细胞形态学改变;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP和Bcl-2、Bax表达的变化。结果:单克隆抗体NJ001可以导致SPC-A1细胞发生凋亡,且凋亡率呈剂量依赖性。显微镜下观察到SPC-A1细胞皱缩变圆,甚至脱落,呈现典型的凋亡改变;Western blot检测结果显示,在单抗NJ001作用下,PARP蛋白被剪切,caspase-3的表达量因被剪切而降低,caspase-8和caspase-9蛋白均表现活化,表现为cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白的表达上调。另外促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。结论:单克隆抗体NJ001能通过诱导细胞凋亡发挥其杀伤肺腺癌细胞的活性,且其凋亡机制与caspase活化和Bcl-2家族蛋白的调节有关。

真菌血流感染患者死亡率相关危险因素分析

目的研究南京医科大学第一附属医院真菌血流感染的病原菌分布及与死亡率相关的危险因素,为临床真菌血流感染提供病原学依据及防治措施。方法收集2016年1月-2018年12月107例真菌血流感染患者临床资料,并按患者结局分为生存组、死亡组,用χ^2检验进行单因素分析,将单因素分析中显示与死亡率相关(P<0.05)的所有变量,采用logistic二元回归进行多因素分析。结果2016—2018年血培养共分离到真菌117株,主要分布于ICU和血液科,占53.0%;排在前三位的菌种分别是光滑念珠菌(28.2%,33/117)、白念珠菌(20.5%,24/117)和近平滑念珠菌(17.9%,21/117)。107例真菌血流感染患者中死亡17例,死亡率15.9%(17/107);单因素分析显示ICU入住、机械通气、抗真菌治疗和初始(1,3)-β-D-葡聚糖>100 ng/L与死亡率相关(P<0.05),logistic二元回归分析结果提示初始(1,3)-β-D-葡聚糖>100 ng/L(OR=6.364,95%CI:1.076~37.623,P=0.041)是与真菌血流感染患者死亡率相关的独立危险因素。结论初始(1,3)-β-D-葡聚糖>100 ng/L是与真菌血流感染患者死亡率相关的独立危险因素,临床应进行血培养和(1,3)-β-D-葡聚糖联合检测,对于阳性结果尽早干预以降低死亡风险。

2012-2016年脑膜脓毒性伊丽莎白金菌临床分布及药敏结果

目的了解南京医科大学第一附属医院脑膜脓毒性伊丽莎白金菌(EM)的临床分布及耐药现状。方法采用回顾性调查方法收集该医院2012-2016年EM临床分离株及有关临床资料,数据用WHONET5.6软件进行统计分析。结果2012-2016年共分离不发酵糖革兰阴性杆菌10 301株,其中EM 27株,占0.26%;菌株主要分离自综合ICU(12株,占44.4%),标本以痰液为主(占77.8%);体外药敏试验结果表明EM对美罗培南耐药率达到100%;对甲氧苄啶-磺胺甲唑敏感率达到100%。结论 EM临床分离率5年间呈上升趋势,对多种抗生素呈现高耐药率,应引起临床足够重视。

肠球菌血流感染临床特征及预后危险因素分析

目的研究南京医科大学第一附属医院肠球菌血流感染(BSI)患者的临床特征及死亡相关危险因素。方法收集2019年1月—2020年12月肠球菌BSI病例的临床资料,包括基础疾病、侵袭性操作,临床指标及治疗等,根据预后将患者分为死亡组和生存组,用χ^(2)检验进行单因素分析,将单因素分析中显示出与死亡率相关(P<0.05)的所有变量,采用logistic二元回归进行多因素分析。结果164例肠球菌BSI患者中,复数菌感染46例,占28.0%;在105例单一肠球菌BSI患者中屎肠球菌是最常见的分离菌(68株,64.8%),其次为粪肠球菌(29株,27.6%),其他肠球菌(8株,7.6%)。屎肠球菌BSI组消化道疾病比例和PCT水平高于粪肠球菌BSI组,但心血管疾病比例低于粪肠球菌BSI组(P<0.05)。屎肠球菌耐药率明显高于粪肠球菌和其他肠球菌,粪肠球菌和屎肠球菌对利奈唑胺耐药率分别为3.4%和0,分离到1株耐万古霉素屎肠球菌。多因素分析显示,感染性休克(OR=77.432;95%CI:7.776~771.089;P<0.001)、高浓度庆大霉素耐药(OR=5.390;95%CI:1.311~22.167;P=0.020)和中心静脉置管(OR=14.869;95%CI:1.546~142.982;P=0.019)是肠球菌BSI患者死亡相关的独立危险因素。结论该院肠球菌BSI以屎肠球菌最常见,其耐药率明显高于其他肠球菌;感染性休克、中心静脉置管和高浓度庆大霉素耐药是影响肠球菌BSI预后的独立危险因素。临床应重视这些因素,对于严重肠球菌BSI患者应及早拔管并进行氨基糖苷类药物联合治疗以改善预后。

社区获得性血流感染病原菌分布及预后危险因素分析

目的:分析社区获得性血流感染(community-acquired bloodstream infection,CABSI)的病原菌分布、耐药情况及预后危险因素,为临床医师诊断及治疗提供依据。方法:收集2017年1月—2019年12月CABSI患者分离的病原菌及临床资料,并按治疗28 d转归分为死亡组和存活组。用χ^(2)检验进行单因素分析,与死亡相关的变量采用Logistic二元回归进行多因素分析。结果:292例CABSI患者分离病原菌323株,其中革兰阴性菌192株,革兰阳性菌118株,真菌9株和厌氧菌4株。革兰阴性菌对头霉素类、碳青霉烯类和氨基糖苷类抗菌药物耐药率均在10%以下,金黄色葡萄球菌对庆大霉素和莫西沙星的耐药率小于20%,链球菌属对青霉素类耐药率为6.7%。292例患者中55例死亡,病死率为18.8%。单因素分析显示脑梗死、感染性休克、肺炎克雷伯菌感染、α溶血链球菌感染、降钙素原(procalcitonin,PCT)升高与患者死亡有关。脑梗死、感染性休克和PCT水平升高是CABSI患者预后相关的独立危险因素(P<0.05)。结论:CABSI患者病原菌对临床常用抗菌药物耐药率较低。脑梗死、感染性休克和PCT升高能显著增加患者病死率,临床医师应及时采取相应防治措施。

顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡过程中miR-638的表达水平研究

目的探讨体内外顺铂(DDP)给药后miR-638表达水平及变化,评价miR-638表达在DDP诱导人肺腺癌细胞凋亡中的意义。方法建立荷SPC-A1瘤的BALB/c裸鼠移植瘤模型,经尾静脉注射DDP后,检测各组裸鼠血清miR-638表达水平。体外培养SPC-A1并经DDP作用不同时间后,检测培养上清miR-638表达水平及细胞凋亡率。收集60例肺腺癌患者DDP化疗前后的血清样本,检测miR-638在化疗前后的表达改变情况并分析其与预后的关系。结果体外DDP处理SPC-A1细胞后凋亡率在24、48和72 h时均显著高于同时间点对照组(P均<0.01),且随时间延长显著增高(任意两组间P<0.01);DDP作用后培养上清中miR-638表达水平呈时间依赖性增高,且在24、48、72 h均显著高于相应对照组(P均<0.05);且SPC-A1培养上清中miR-638水平与凋亡率呈正相关(r=0.711,P<0.01);DDP治疗组裸鼠血清miR-638表达水平明显高于生理盐水处理组和未治疗对照组(P均<0.05),而后两组间差异无统计学意义(P>0.05);接受DDP化疗后血清miR-638表达上调的患者总体生存率明显高于表达下调者(P<0.05)。结论 miR-638在体内和体外DDP诱导的人肺腺癌细胞凋亡中均出现表达上调,提示miR-638可能对肺癌DDP化疗中判断预后及疗效观察具有一定价值。