犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

5株乳酸菌的分离鉴定与生物学特性研究

从泡菜和仔猪粪便中分离出5株乳酸菌,分别命名为RS、RB、RFT、RST、RO,结合细菌形态学、生理生化特性和16S rRNA序列同源性分析进行鉴定,并对其特性进行了研究。结果表明RS菌株为植物乳杆菌,RB、RO菌株为粪肠球菌,RFT、RST为屎肠球菌。其中RS菌株具有较好的耐酸性、一定的胆盐耐受力,对温度敏感;RB、RFT、RST、RO菌株对模拟肠液具有较强的耐受力,45~55℃处理30 min不影响其生长;5个菌株对大肠杆菌O157和沙门氏菌的抑菌率均达到98%~100%,可作为优良的益生菌候选菌。

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。

嵌合O型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒VLPs载体疫苗的构建

综合运用生物信息学和分子生物学技术,模拟PPV VP2蛋白表面不同Loop区插入O型FMDV VP1蛋白上多表位基因(VP1:21～40、141～160和200～213残基)空间构象,并在VP2 N端引入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE),人工合成嵌合基因并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTA中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV VP1∶PPV VP2,用脂质体法转染Sf9细胞。对rBac-FMDVVP1∶PPV VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用Western-blotting分析,在64 000处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组VP2蛋白能够自主组装成病毒样颗粒。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白PPV∶VP2-FMDV∶VP1具有与全病毒类似的血凝活性。

重组表达口蹄疫病毒T细胞表位猪细小病毒病毒样颗粒的制备

为增强表位疫苗的免疫原性,本研究将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1中编码T细胞表位肽(aa 21～aa 40)序列连接于猪细小病毒(PPV)VP2的5'端,并插入到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中,构建成重组转座载体pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转染昆虫草地夜蛾(Sf9)细胞,并在Sf9中进行了表达。电镜观察显示,表达的重组蛋白能够自我组装成病毒样颗粒rPPV∶VLP(FMDV)。用间接免疫荧光试验(IFA)、western blot分析表明,表达产物具有与PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫实验证实,在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应;而且该病毒样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反应。

应用微量凝集法检测家兔大肠杆菌抗体水平的试验

本试验应用兔源致病性大肠杆菌 E1、E2、E7株的培养物经 12 1℃高温处理 2 h,制成含 0 .5 %石炭酸生理盐水的大肠杆菌“O”抗原悬液 ,抗原凝集效果呈现出最佳的检测工作浓度为 12亿细菌 / m l,应用该方法检测免疫过兔大肠杆菌疫苗的家兔血清抗体峰值达 1∶ 12 8,而从非免疫兔和免疫过兔瘟、多杀性巴氏杆菌病。

犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12。相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位。选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化。结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5μg/mL,变异系数小于6%。利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100%。本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测。

测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立

通过氯仿和PEG6000处理,SephadexG 200层析纯化RHDV抗原,建立了检测RHDV抗体的间接ELISA试验方法。该方法的抗原最适包被浓度为10μg/ml,血清样品最佳稀释度为1∶400。与血凝抑制试验方法(HI)等相比,该方法具有快速、简单、特异性和重复性好等优点。

家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗超纳滤膜浓缩工艺研究

采用超纳滤技术浓缩家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗,建立家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗浓缩工艺。配制家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗,并对其无菌性、安全性和免疫效力进行了检验。结果显示,该工艺可将家兔产气荚膜梭菌(A)型灭活抗原浓缩约7倍,超纳滤膜用NaOH洗后其通量可以恢复;配制的家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗无菌检验合格,安全检验家兔无不良反应,符合动物用生物制品要求;以2 mL/只的剂量免疫家兔,家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗的保护率达100%,传统铝胶疫苗对照组的保护率平均为86.7%,表明超纳滤浓缩疫苗免疫效力优于传统铝胶疫苗。确定了家兔产气荚膜梭菌病(A)型疫苗超纳滤膜膜浓缩的工艺。

鸡p53抑制传染性法氏囊病病毒复制及gga-miR-2127对其调控的分子机制

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。肿瘤抑制蛋白p53能够抑制多种病毒的复制,但对IBDV复制的影响仍然不清楚。本研究以IBDV为模式病毒,采用体外感染模式,在IBDV感染的DF-1细胞中,p53的表达水平和活性均显著升高。p53过表达可以抑制IBDV的复制,并激活鸡体抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表达水平上调;抑制p53的表达则得到相反的结果;表明p53可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV感染作用。利用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现,gga-miR-2127可以作用于p53 mRNA的3'UTR;荧光定量RT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-2127过表达可以使鸡体的抗病毒天然免疫基因表达降低,IBDV复制水平升高。本研究表明:gga-miR-2127可以作用于p53 mRNA的3'UTR调控p53的表达从而影响其下游抗病毒天然免疫基因的表达来发挥抗IBDV感染的作用。

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析

2012年从南京市某宠物医院采集的20份犬鼻拭子中分离到1株犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）,命名为A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）.该病毒分离株的血凝素（hemagglutinin,HA）效价为28,鸡胚半数感染量（median embryoinfective dose,EID50）和最小致死量平均死亡时间（mean death time,MDT）分别为10-7.60/0.1 mL和69.6h/10-4.血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因和核蛋白（necleoprotein,NP）基因的系统发育进化树均显示该分离株CIV位于禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）亚群中,并与H3N2亚型CIV辽宁分离株和黑龙江分离株位于同一分支上,具有最近的亲缘关系（HA基因的同源性为99.5％～99.6％,NA基因的同源性为99.0％～99.2％,NP基因的同源性为99.1％～99.3％）.氨基酸序列分析显示,该病毒分离株与其他犬流感病毒分离株的HA、NA和NP氨基酸序列存在个别位点的突变.

传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别采用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的m RNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2 h到24 h内,ch MDA5、ch TLR3、ch LGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225 000和18 700倍。当采用si RNA分别敲除DT40细胞中ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2 h到24 h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,ch MDA5和ch TLR3的表达显著降低,而ch LGP2表达无显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了PRRS ch MDA5和ch TLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。

gga-miR-142-5p负调控chMDA5抗传染性法氏囊病病毒感染的分子机制

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)及激活宿主的天然免疫应答中具有重要的作用,但chMDA5识别IBDV的分子机制仍然不清楚。本研究用IBDV感染DT40细胞,在IBDV感染的DT40细胞中,chMDA5的表达水平显著升高。chMDA5过表达可以抑制IBDV的复制,并激活IFN-β promoter和Mx promoter活性,chMDA5抑制表达则得到相反的结果;chMDA5激活IFN-β promoter活性主要是通过IRF7通路。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-142-5p可作用于chMDA5的3'UTR;qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-142-5p可依赖IRF7通路使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低,IBDV复制水平升高。本研究表明,gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR负调控chMDA5的表达从而影响其下游IFN-β promoter和Mx promoter活性来发挥抗IBDV感染的作用。

犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

宠物浅表皮肤真菌病主要由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌感染引起。本研究根据3种真菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)区域的序列差异设计4条引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR,同时对其特异性、灵敏性、重复性进行分析。结果显示,建立的多重PCR方法对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌基因组DNA均可扩增出特异性预期片段,条带大小分别为286、596、188 bp;最低检测限(灵敏性)分别为12.6、8.8、13.6pg/μL;被检测的6份人工模拟样品扩增结果准确。应用该多重PCR方法检测27份人临床皮屑样品和43份宠物犬、猫毛发样品,结果显示阳性检出率分别为74.07%(20/27)和83.72%(36/43);采用常规真菌分离培养法从阳性样品中获得10株致病性真菌,分离率为17.86%(10/56);两种检测方法的种属鉴定结果表明多重PCR法优于常规方法。本研究建立的多重PCR检测方法简便、特异、灵敏,可同时对宠物浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

实验兔生物净化初报

采用无菌剖宫产仔兔人工哺乳技术,对普通级新西兰兔进行微生物和寄生虫净化,4窝剖宫产兔共产仔兔24只,存活率100%。30日龄离乳存活22只,存活率91.7%,离乳平均体重478.9g。将此离乳兔由隔离器移至屏障设施中饲养繁殖。通过2年的两次微生物、寄生虫检测,结果表明符合SPF兔的要求。

犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac1-HBM-Alb-CaIFN-α2,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选纯化,得到的重组穿梭质粒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2转染Sf9细胞,72 h后可观察到明显的细胞病变。用第三代重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2感染Sf9昆虫细胞,感染3 d后,收获昆虫细胞和细胞培养物,间接免疫荧光(IFA)结果显示,重组杆状病毒感染的细胞呈现绿色荧光;Western blot检测结果显示,在约90 ku左右可观察到特异性条带,证实重组Alb-CaIFN-α2能够在昆虫细胞中表达。利用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性,结果显示重组Alb-CaIFN-α2的活性为1.70×10 6 U·mL^-1,为进一步研究新型犬用干扰素制品奠定了试验基础。

兔病毒性出血症与多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的试制和效果

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗于江苏省农业科学院兽医研究所畜禽生物制品研究开发中心试制 5批 ,计 10 0余万头份。疫苗效力试验对兔病毒性出血症总保护率为 10 0 %;对兔多杀性巴氏杆菌病总保护率为 95 %。疫苗于苏、鲁、皖、浙、沪、晋、闽、津等省、市养兔单位应用 ,据反馈信息表明 ,疫苗安全、有效。确认本疫苗的生产工艺成熟、可行 ,可进行工厂化生产。所生产的二联苗能有效预防该两病的发生。

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A)型三联灭活疫苗研制

对 5批兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病三联灭活疫苗进行了动物试验 ,结果表明该疫苗安全有效。近期效检对兔病毒性出血症的保护率为 1 0 0 % ,对兔多杀性巴氏杆菌病保护率为 92 % ,对产气荚膜梭菌病 (A)型保护率为 88%。在免疫期试验中 ,免疫 6个月后 ,对兔病毒性出血症保护率为 1 0 0 % ,对多杀性巴氏杆菌病的保护率为 79% ,对产气荚膜梭菌病 (A)型的保护率为 88%。在保存期试验中 ,4～ 8℃保存 1年仍有效。