广东省阿卡斑病毒和OYAV的检测及分子特征研究

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)和Oya病毒(Oya virus,OYAV)均属于泛布尼亚病毒科、正布尼亚病毒属的两种病毒,可引起动物疾病,目前广东省尚不清楚是否存在这两种病毒。为了解这两种病毒在广东省的存在状况及分子特征,2018年4月至7月,分别在广东省的佛山、信宜、河源和阳江四个地市利用人诱法和诱蚊灯法采集吸血昆虫标本。采集的标本分类后,按20~50只/批,蠓虫按200~500只/批分装,液氮保存运输。标本破碎离心后,上清用于接种细胞和病毒核酸提取。Real-time RT-PCR检测AKV和OYAV阳性的样本用于S基因的扩增、测序和系统进化分析。本次研究共采集各类吸血昆虫421批次,Real-time RT-PCR检测AKV阳性10份,均来自蠓虫标本,RT-PCR检测AKV阳性5份,其中4份成功测序;Real-time RT-PCR检测OYAV阳性15份,其中蠓虫13份、中华按蚊和三带喙库蚊各1份,RT-PCR检测OYAV阳性6份,其中4份成功测序。病毒分离结果均为阴性。进化分析结果显示,所有序列共分为5个血清群,本次研究的8条序列均位于Simbu群,其中4个新毒株与OYAV代表株NIV86209的核苷酸同源性最高可达96.87%,氨基酸同源性最高为100%;另外4株新病毒与AKV代表株GXLCH02的核苷酸同源性最高达98.60%,氨基酸同源性最高为99.57%。本研究结果揭示,AKV和OYAV在广东省的虫媒中分布广泛,主要以蠓虫分布为主,来自蠓虫中的新OYAV和AKV与其它媒介或宿主中的AKV和OYAV高度同源,未显示明显媒介差异的分子特征。

我国首例寨卡病毒的分离与鉴定

目的：建立寨卡病毒分离方法,为寨卡病毒的分离积累经验。方法将寨卡病毒血清阳性标本通过颅内注射途径接种1~3日龄BALB/c乳鼠,接种6日后处死,提取乳鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤和肠组织,均浆取上清提取病毒核酸,real-time RT-PCR进行核酸检测鉴定。阳性脑组织上清进行乳鼠传代接种。分离的病毒株用巢式PCR进行扩增,所获得的序列用MEGA6.0软件进行系统进化分析。结果从接种寨卡病毒的乳鼠脑、心和肝等组织中均可检测出寨卡病毒核酸,其中心和脑组织寨卡病毒Ct值最低,分别为24.4和25.3个循环。传代乳鼠病毒接种后2日可在乳鼠脑组织中检测出病毒核酸。巢式PCR成功扩增出1034个碱基大小的片段,进化分析结果显示本次分离的毒株属于亚洲族系。结论利用乳鼠颅内接种法,成功分离1株寨卡病毒,该病毒属于亚洲族系。

中国18例输入性寨卡病毒感染者实验室检测结果分析

目的：了解寨卡病例的排毒途径和时间，为寨卡病例的实验检测提供科学依据。方法收集寨卡病例不同时间的多类临床样本，用real-time RT-PCR方法对其进行核酸检测，阳性标本进行乳鼠颅内和细胞接种分离寨卡病毒，将获得的寨卡病毒利用二代测序方法进行全基因组测序，所测得的序列与GenBank中寨卡序列进行系统进化分析。结果18例感染者尿液、唾液和血清样本中寨卡病毒核酸阳性率分别为82.4%（14/17）、82.4%（14/17）和52.9%（9/17），尿液排毒的持续时间最长，其次是唾液和血液。9份阳性血清标本共分离到6株寨卡病毒，进化分析6条寨卡基因组序列均属于亚洲族系，来自萨摩亚与委内瑞拉的病毒位于不同的进化分支中。结论唾液、血清和尿液均可用于寨卡病例的日常检测，尿液和唾液的核酸检测率更高，阳性血清更容易分离到寨卡病毒。乳鼠和细胞均可用于寨卡病毒的分离，但乳鼠颅内接种的病毒分离率更高。

广东省吸血蠓一新种及一中国新纪录(双翅目:蠓科)

该文报道了广东省恩平市吸血蠓一新种和一中国新纪录种:恩平库蠓(Culicoides enpingensis Wu et Liu,sp.nov.)和柯卡库蠓(C.calcaratus Wirth et Hubert,1989)。恩平库蠓与龙溪库蠓(C.lunchiensis Chen et Tsai,1962)相近似,但后者翅径5室和臀室基部淡斑的形状不同;雄虫阳茎中叶端部有1对耳状突,末端钝圆,阳基侧突端部有细分枝与本新种明显不同。新种模式标本保存在沈阳军区CDC(沈阳110034)。

广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究

了解广东省目前流行的乙型脑炎病毒的基因型别,以及新分离毒株与P3和SA14-14-2疫苗株E蛋白的氨基酸差异,推测疫苗株的可能保护效果。本研究对广东省2017年从蚊虫和蠓虫标本分离的10株乙型脑炎病毒基因组序列测定,利用MEGA软件登录GenBank下载乙型脑炎病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与疫苗株进行氨基酸同源性比对和E蛋白的序列分析。10株乙型脑炎病毒均属基因I型GI-b组,但分别位于2个不同的、小的进化分枝中。10株新分离病毒与P3和SA14-14-2疫苗株的E蛋白氨基酸同源性分别位于97.40%~97.60%和97.20%~97.40%之间。E基因区段500个氨基酸中,P3株与新分离乙型脑炎病毒株之间共存在17个氨基酸位点的差异(包括12个共同氨基酸的改变),略高于SA14-14-2疫苗株的16个氨基酸位点变异(包括11个共同氨基酸的改变)。其中在DI区的P3和SA14-14-2株分别有1个和3个共同氨基酸变异,DⅡ区各有5个共同氨基酸改变,DⅢ区分别有5个和2个共同氨基酸改变,结构域之外各有1个共同氨基酸的变异。绝大多数变异发生在非关键位点,只在E306和E388处观察到的氨基酸位点变异与疫苗P3株关键位点的改变有关,这两个位点(G306E,E388G)均发生在DⅢ区,而疫苗SA14-14-2未观察到关键位点的改变。总之,广东省流行的乙型脑炎病毒基因型别可能已由Ⅲ型变为I型;疫苗SA14-14-2株及P3株与新分离毒株均具有很高的同源性,绝大多数关键氨基酸位点未发生变异,对新分离病毒均具有良好的免疫保护价值。

广东省三株蚊媒黄病毒的鉴定和系统进化分析

为了解广东省蚊媒病毒的种类和分子特征,本研究对从蚊子中分离的三株黄病毒提取病毒核酸并进行二代测序,经序列拼接和比对,基因组序列中缺失的gap通过RT-PCR进行扩增填补。用MEGA软件登录GenBank下载黄病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与新毒株进行氨基酸同源性比对和编码框序列的分析。结果显示利用二代测序技术获得了三株病毒基因组序列的96.35%～98.26%,并用RT-PCR成功补齐所有gap,序列比对显示其中一株与黄斑库蚊病毒核苷酸和氨基酸同源性98.51%,两株病毒与广平病毒的核苷酸同源性分别为97.30%和89.78%。三株病毒都属于黄病毒家族中的未分类黄病毒或昆虫特异性黄病毒,编码区序列中C蛋白的同源性最低,NS5的同源性最高。本研究发现的三株蚊媒黄病毒中,库蚊黄斑病毒在国内为首次鉴定;两株广平病毒核苷酸同源性存在较大差异,可能存在不同基因亚型。

登革病毒非结构蛋白1抗原检测试剂的比较

目的调查登革热病毒非结构蛋白1（NS1）抗原检测试剂的敏感性和特异性，为诊断标准的修订提供依据。方法于2010年5月至2016年11月，从广州、东莞和中山三地登革热监测点医院，共收集核酸检测或病毒培养物阳性者300例。同期同地采集登革病毒核酸阴性的人群血液标本308例作为对照组。采用调查问卷收集研究对象的相关信息。分别选用胶体金试剂（国产和进口）、ELISA试剂（国产和进口）在上述3个城市进行登革热抗原检测，计算并比较不同试剂的灵敏度、特异度和符合率，以中山地区作为第三方检测。结果阳性组男性为133例，女性为167例，年龄为（47.2±13.3）岁，其中登革Ⅰ型为179例，登革Ⅱ型为110例，登革Ⅲ型为11例；对照组男、女病例均为154例，年龄为（40.1±11.6）岁。国产ELISA试剂灵敏度（94.5%）低于进口试剂（99.5%），差异有统计学意义（χ2=8.59，P=0.030）；NS1抗原检测Ⅰ型登革病毒的灵敏度和特异度均高于97.0%；检测Ⅱ型登革病毒时，国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和95.0%，特异度分别为96.8%和100%，进口ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为100%和98.0%，特异度分别为99.4%和100%。第三方检测结果显示国产ELISA和胶体金试剂的灵敏度分别为90.0%和98.0%，差异有统计学意义（χ2=5.67，P=0.020）。结论NS1检测试剂均具有较高的灵敏度和特异度，可以作为登革热病例的早期筛查检测。

广州市2015年流行性出血热抗体阴性样本病原谱分析

目的了解广州市疑似流行性出血热患者抗体检测阴性的血清样本的病原谱特征,为医疗机构的临床诊断提供参考依据。方法收集2015年广州市疑似流行性出血热患者抗体检测阴性的血清样本进行登革病毒、恙虫病东方体、发热伴血小板减少综合征病毒和钩端螺旋体等4种病原体的筛查。登革病毒、钩端螺旋体和发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体检测分别采用捕获ELISA法或双抗体夹心ELISA法;恙虫病东方体IgM/IgG抗体和核酸检测分别采用胶体金免疫层析法和巢式PCR方法。采用蚀斑减少中和试验和显微镜凝集试验分别对登革病毒和钩端螺旋体的ELISA阳性结果进行确认试验。结果共收集193份出血热阴性样本,登革病毒抗体阳性5份,阳性率为2.59%;钩端螺旋体抗体阳性3份,阳性率为1.55%;恙虫病东方体抗体阳性15份,阳性率为7.77%,其中核酸阳性9份,测序分型有4个基因型(Karp型、Kato型、Gilliam型、Kawasaki型);发热伴血小板减少综合征新布尼亚病毒抗体检测均为阴性。结论登革病毒、恙虫病东方体和钩端螺旋体在广东省均存在一定程度的感染,未发现发热伴血小板减少综合征病毒感染的实验室确诊病例。

恙虫病东方体56-kDa型特异性抗原基因的表达及抗原性鉴定

目的表达和鉴定恙虫病东方体特异性诊断抗原,为恙虫病诊断试剂的研发提供实验基础。方法从恙虫病病例血液标本中提取恙虫病东方体核酸,PCR扩增4个不同基因型56-kDa特异性抗原基因,目的基因被定向克隆到原核表达载体pET-30a (+),在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定和镍柱纯化,用患者恢复期血清进行免疫印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的抗原性。结果从4个不同基因型别的病例血清中扩增出Karp、Kato、TA763和Gillima的部分56-kDa抗原基因,片段大小为1 350 bp～1 410 bp,分别表达并纯化出分子量大小为56. 59 kDa～58. 44 kDa的4个重组蛋白,重组的4种蛋白均与恢复期病例血清有良好的反应。结论成功表达出恙虫病东方体4个型特异性抗原蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性。

一株新正黏病毒(龙川病毒)的鉴定及分子特征研究

2013年在中国广东省开展了虫媒病毒分布及其分子特征的研究,在广东省龙川县采集的致倦库蚊中分离到一株病毒,该病毒可以引起C6/36细胞的病理性效应。为了对该病毒进行鉴定,并对其分子特征进行研究,将病毒培养物用氯化铯进行梯度离心,负染电镜观察病毒的形态,提取并单引物等温扩增(SPIA)病毒RNA,利用Ion Torrent平台进行深度测序,获得的序列用CLC Genomic Wokbench 9.0软件进行拼接,本地BLAST进行分类比对。用MEGA软件登录GenBank,下载正黏病毒科代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与新毒株进行氨基酸同源性比对和编码框序列的分析。电镜观察结果显示该病毒呈球形,直径大小约100nm;深度测序共获得6个完整开放阅读框(Open reading fragment,ORF)的节段序列,5个节段(PB1、PB2、PA、NA、HA)的氨基酸序列与正黏病毒科的Quaranjavirus属病毒同源关系在26.38%~67.23%之间,其中PB1的同源性最高,PB2的同源性最低,未发现与其它病毒有同源关系。本研究在中国首次从蚊虫中分离并鉴定了一株新的虫媒病毒,属于正黏病毒科Quaranjavirus属的家族成员,命名为龙川病毒,这是中国国内首次报道从致倦库蚊中分离到龙川病毒。

克雅氏病的研究进展

克雅氏病潜伏期长,病程短,病死率高。自1922年报道以来,每年世界各地都不断地有新病例发生,却没有有效的治疗措施,目前只能做好监测和预防工作,但还是有学者不断地在发病前诊断和治疗方面努力着。本文就目前该病的研究进展进行综述。

广东省发热伴出血症候群监测病原谱分析

目的了解广东省发热伴出血症候群临床病例相关病原体感染情况,为临床诊断治疗和预防控制提供科学依据。方法选择广东省3个地市的6家医院作为哨点医院,共采集样本282份。分别使用捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)法、间接ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测登革病毒(DENV))、汉坦病毒(HTNV)、人钩端螺旋体(LS)和新布尼亚病毒(NBYV)Ig M/Ig G抗体;分别使用胶体金免疫层析法和巢式PCR方法检测恙虫病东方体(Ot)Ig M/Ig G抗体和核酸;采用蚀斑减少中和实验和显微镜凝集试验分别对DENV和LS的抗体阳性结果进一步确认。结果 DENV、HTNV、Ot、LS和NBYV抗体的阳性率分别为4.61%(13/282)、3.55%(10/282)、24.82%(70/282)、32.66%(65/199)和0.39%(1/254),其中NBYV抗体仅1例Ig G阳性。DENV抗体中和实验确认6份标本阳性,LS显微凝集实验确认6份标本抗体阳性。恙虫病东方体核酸共有11份阳性,测序分型共有4个基因型。结论登革病毒、汉坦病毒、恙虫病东方体和人钩端螺旋体在广东省人群中均存在一定程度的感染率,但尚未发现存在新布尼亚病毒感染的实验室确认证据。

人血清中寨卡病毒微量中和抗体检测方法的建立和应用

目的 建立人血清寨卡病毒（ZIKV）微量中和抗体检测方法,并用10例经核酸检测和/或病毒分离确诊的寨卡输入病例的急性期和恢复期血清样本进行分析验证.方法 采用分离自输入寨卡病例的寨卡病毒株开展组织培养微量中和抗体测定,在BHK21、VERO和VERO-E6 3种细胞系中选择感染寨卡病毒后能产生典型CPE的细胞系制备病毒储备液,滴定病毒滴度;使用100TCID50的病毒液与连续4倍稀释的经56℃ 30 min灭活的血清于37℃中和2h,然后加入细胞悬液.5％二氧化碳培养箱孵育,逐日观察CPE.结果 BHK21、VERO和VERO-E63种细胞系对寨卡病毒感染的敏感度不同,其中VERO细胞最为敏感,可出现典型的CPE;应用VERO细胞系建立寨卡病毒微量中和抗体检测方法能准确反映寨卡确诊病例急性期和恢复期血清中和抗体水平,并能作为一种特异性诊断方法.结论 寨卡病毒微量中和抗体检测方法不仅可用于人感染寨卡病毒的实验室诊断,还可用于人群血清流行病学调查.