荷叶碱抑制Akt/mTOR/4EBP1-糖酵解通路抗胆管癌细胞增殖作用研究

本研究基于网络药理学探究荷叶碱抑制人肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖的分子机制。采用MTT比色法、克隆形成实验检测荷叶碱对HuCCT1细胞增殖的影响;采用比色法、分光光度法检测荷叶碱对糖酵解生化指标的影响;通过网络构建和富集分析预测荷叶碱作用于肝内胆管癌的潜在靶点及通路,以此为基础探究荷叶碱影响HuCCT1细胞增殖的可能机制。结果表明荷叶碱能抑制HuCCT1增殖,显著降低细胞葡萄糖消耗及乳酸生成,并呈时间和剂量依赖性;网络药理学分析显示荷叶碱主要通过PI3K/Akt、MAPK、HIF-1信号通路影响肝内胆管癌生长、运动;聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)结果显示(30、60、120μmol/L)荷叶碱能降低低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、己糖激酶2(HK2)和丙酮酸激酶2(PKM2)的mRNA水平和蛋白表达,同时下调p-Akt^(Thr308)、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表达。综上,荷叶碱可能通过影响Akt/mTOR/4EBP1信号级联调控的糖酵解活性抑制HuCCT1细胞增殖。

基于网络药理学和实验验证探讨中药枇杷叶抑制三阴性乳腺癌的分子机制

目的:基于网络药理学和实验验证探讨中药枇杷叶抑制三阴性乳腺癌的分子机制。方法:通过TCMSP数据库获取中药枇杷叶的潜在药效成分及靶点。利用GeneCards、OMIM及DisGeNET数据库获取三阴性乳腺癌的相关靶点。利用String平台进行蛋白互作分析。采用Metascape数据库分析潜在靶点参与的生物过程及通路。通过CB-Dock进行分子对接验证。采用MTT比色法和平板克隆形成实验检测中药枇杷叶潜在药效成分对4T1细胞增殖活性的影响。采用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达水平。结果:中药枇杷叶有18个潜在药效成分和147个潜在靶点作用于三阴性乳腺癌。齐墩果酸(oleanolic acid,OA)和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)等成分与TP53和AKT1等靶点的亲和力强。OA和EGCG可以时间和剂量依赖的方式抑制4T1增殖,减少p-AKT、p-mTOR蛋白表达,并上调细胞周期调控因子p27的表达水平。结论:中药枇杷叶中的OA和EGCG可以通过调节PI3K-AKT信号通路,上调细胞周期调控因子p27,抑制三阴乳腺肿瘤细胞的侵袭和复制,从而抑制乳腺癌细胞增殖。

肝癌进展的自噬机制及中药活性成分调控研究进展

肝癌是临床常见的高致死率恶性肿瘤,目前虽在肝癌的诊断和治疗上取得了较大进展,但仍存在患者预后不佳等问题。近年来研究表明,中药活性成分在肝癌的治疗中发挥积极作用,其机制可能与中药活性成分靶向调节细胞自噬有关。自噬作为细胞分解代谢途径之一,通过溶酶体降解细胞内潜在的有害物质,发挥保护细胞内环境稳态作用,是防治肝癌研究领域的热点问题。大量研究表明,中药活性成分可通过靶向细胞自噬途径诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞侵袭与转移、降低肝癌细胞耐药性。中药活性成分来源广泛,积极探寻在肝癌进展过程中具有调控细胞自噬作用的中药活性成分,对肝癌预防和治疗具有一定的应用前景及重要的科学意义。本文对近年来国内外研究现状进行分析,综述了中药活性成分调控自噬防治肝癌的临床前研究进展,以期为开发潜在的抗肝癌创新中药提供参考。

淫羊藿素通过Akt/mTOR调控糖酵解抑制肝内胆管癌细胞增殖的作用机制研究

目的探究淫羊藿素对人肝内胆管癌HuCCT1细胞增殖的影响及其作用机制。方法CCK-8法检测淫羊藿素对HuCCT1细胞增殖活性的影响;平板克隆法检测淫羊藿素对HuCCT1细胞集落形成能力的影响;流式细胞术检测淫羊藿素对HuCCT1细胞周期的影响;分光光度法检测淫羊藿素对HuCCT1细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成量以及己糖激酶(hexokinase,HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性的影响;Western blotting法检测淫羊藿素对HuCCT1细胞中增殖相关蛋白和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路及糖酵解相关蛋白表达的影响;Western blotting检测淫羊藿素对瞬时转染Akt基因质粒的HuCCT1细胞中Akt/mTOR及糖酵解相关蛋白表达的影响。结果淫羊藿素显著抑制HuCCT1细胞的活力,并呈时间和剂量相关性;淫羊藿素呈剂量相关性地抑制HuCCT1细胞的集落形成(P<0.001);淫羊藿素可以将HuCCT1细胞周期阻滞在G 1期,并显著降低增殖相关蛋白的表达水平(P<0.05);淫羊藿素可以显著降低HuCCT1细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量及ATP生成量(P<0.05、0.01、0.001);淫羊藿素显著抑制糖酵解相关酶(HK、PK)的活性以及蛋白表达水平(P<0.05、0.01、0.001);淫羊藿素显著降低磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR)、磷酸化核糖体蛋白S6(phosphorylated ribosomal protein S6,p-RPS6)的蛋白表达水平(P<0.05、0.01);淫羊藿素显著降低Akt基因过表达的HuCCT1细胞中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2的蛋白表达水平(P<0.05、0.01、0.001)。结论淫羊藿素能够抑制HuCCT1细胞的增殖,其作用机制可能与Akt/mTOR信号通路调控的糖酵解途径有关。

表没食子儿茶素没食子酸酯通过AKT/SREBP-1/FASN信号通路调节HepG2细胞脂代谢的作用

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)通过AKT/SREBP-1/FASN信号通路抑制脂肪酸从头合成,调节肝癌HepG2细胞脂代谢的作用。方法运用CCK-8法检测不同浓度EGCG对HepG2细胞的细胞毒性;采用油酸诱导建立HepG2细胞脂肪变性模型,运用油红O染色法观察EGCG对油酸诱导HepG2细胞脂肪变性的改善作用,测定细胞内甘油三酯(triglycerides,TG)的含量;运用实时荧光定量PCR检测胆固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)mRNA的表达水平;Western blotting检测p-AKTThr308、SREBP-1、FASN蛋白的表达水平;运用AKT质粒瞬时转染进一步确证EGCG对p-AKTThr308、SREBP-1、FASN蛋白表达水平的影响。结果油酸诱导后,运用油红O染色可见HepG2细胞内具有大量脂质累积,TG含量显著升高(P<0.05),FASN、SREBP-1 mRNA表达水平升高,p-AKTThr308、SREBP-1、FASN蛋白表达水平升高,AKT质粒转染后p-AKTThr308、SREBP-1、FASN蛋白表达水平升高(P<0.05);给予EGCG(20,40μmolŸL^(‒1))作用后,细胞内脂质累积明显减少,TG含量显著降低(P<0.05),FASN、SREBP-1的mRNA表达降低,p-AKTThr308、SREBP-1、FASN蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论EGCG可能通过调控AKT/SREBP-1/FASN信号通路抑制脂肪酸从头合成,发挥调节HepG2细胞脂代谢的作用。

葫芦素B调控糖酵解抑制HuCCT1细胞增殖的作用机制

目的:探究葫芦素B(CuB)抑制细胞增殖和糖酵解的作用机制。方法:采用细胞增殖与活性检测-8(CCK-8)法检测CuB(0、40、80、120、160、200、400、800 nmol·L^(-1))对HuCCT1细胞增殖的影响;采用平板克隆实验检测CuB(50、100、200 nmol·L^(-1))对HuCCT1细胞集落形成能力的影响;采用流式细胞术检测CuB(50、100、200 nmol·L^(-1))对HuCCT1细胞周期的影响;采用可见分光光度法检测CuB(50、100、200 nmol·L^(-1))给药后HuCCT1细胞中糖酵解关键酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)活性,及葡萄糖消耗量、乳酸生成量和三磷酸腺苷(ATP)生成量的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CuB对细胞周期相关蛋白、增殖相关蛋白、糖酵解关键蛋白及蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路相关蛋白表达情况的影响。结果:与空白组比较,给药24 h,160~800 nmol·L^(-1)CuB,给药48 h后80~800 nmol·L^(-1)可以抑制HuCCT1细胞增殖(P<0.05,P<0.01),并呈时间和浓度依赖性,给药48 h半数抑制浓度为200 nmol·L^(-1);CuB可以呈浓度依赖性的抑制HuCCT1细胞集落形成能力(P<0.01);CuB能够将HuCCT1细胞周期阻滞在G2期(P<0.05,P<0.01);CuB(100、200 nmol·L^(-1))可以抑制糖酵解关键酶HK、PK的活性,并降低细胞葡萄糖消耗量及乳酸和ATP的生成量(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,CuB(100、200 nmol·L^(-1))可以抑制周期相关蛋白Cyclin B1、增殖细胞核抗原(PCNA)、己糖激酶1(HK1)、己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶1(PKM1)、丙酮酸激酶2(PKM2)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)及磷酸化核糖体蛋白(p-RPS6)的蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:CuB可能通过调控Akt/mTOR通路抑制HuCCT1细胞糖酵解进而影响细胞增殖。