跨膜型TNF-α突变体(Δ-28)的正向和反向信号对U937细胞的作用

目的观察跨膜段突变TM-TNF-α(Δ-28mTM-TNF-α)正反向信号诱导U937促炎因子表达的影响。方法Δ-28mTM-TNF-α质粒分别转染COS-7,检测表达的Δ-28mTM-TNF-α诱导U937产生NO的量。同样Δ-28mTM-TNF-α质粒转染U937,sTNFRI激活反向信号后,检测U937促炎因子IL-8以及IL-1β的mRNA转录水平。结果Δ-28mTM-TNF-α不能够诱导U937产生NO,但被激活并传递反向信号促使U937的促炎因子转录和表达。结论跨膜段突变抑制了TM-TNF-α正向信号但不影响反向信号的传递。

人可溶性TNF受体Ⅱ克隆、原核表达与活性鉴定

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)原核基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达之。方法采用RT-PCR技术,从人外周血的单核细胞中扩增出肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)基因的胞外区,将其克隆入pET28a(+)高效表达载体进行诱导表达,并对表达产物进行纯化及鉴定。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,转入外源基因的大肠埃希菌BL21(DE3)可高效表达sTNFRⅡ蛋白,SDS-PAGE显示在32kD处有一特异表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的30%左右。纯化的sTNFRⅡ经Western blot鉴定具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示它可有效地封闭分泌性肿瘤坏死因子α(sTNF-α)对L929细胞的胞毒效应;直接免疫荧光显示它可以特异性抑制GFP-sTNF-α与靶细胞肿瘤坏死因子受体的结合。结论通过基因工程技术获得了人sTNFRⅡ的重组蛋白。