斑马鱼akt3基因的克隆及其表达图谱与过表达分析

采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆得到了斑马鱼的akt3/pkbγ基因,其cDNA全长为2874 bp,编码479个氨基酸。斑马鱼Akt3具有Akt家族成员间保守的PH结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守的磷酸化位点Thr305和Ser472。与已发表的人、大鼠、小鼠的Akt3氨基酸序列比较,相似性分别为95.8%、94.7%和95.4%。对斑马鱼早期胚胎进行RT-PCR检测显示,akt3在0—4hpf(hours post fertilization)含量水平较高,6hpf到12hpf降低至较低水平,16hpf后表达量开始逐渐上升,60hpf至96hpf则稳定在较高水平。原位杂交结果表明:akt3在2hpf至96hpf的胚胎中整体都有表达,没有组织特异性。在成鱼中,除鳃部外,akt3在所检测的其他各组织器官中均有表达,在脑部和卵巢表达量较高;利用显微注射持续表达myr-akt3 mRNA研究其功能充分性时结果显示,过量表达斑马鱼akt3 mRNA能使斑马鱼胚胎发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3注射组发育至24hpf时观察(以排除akt3造成的发育延迟的影响),发现注射过akt3的斑马鱼胚胎的脑部厚度较对照组显著增大,表明akt3对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。