病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶ApCPS功能

该研究采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS),以生长到第8片真叶期的穿心莲植株为实验材料,沉默参与穿心莲内酯生物合成的ent-柯巴基焦磷酸合酶基因(ApCPS),用半定量和荧光定量PCR检测病毒诱导沉默后ApCPS及其上游基因的表达,用HPLC法检测ApCPS沉默后穿心莲内酯的积累变化,同时检测茉莉酸甲酯(MeJA)处理后ApCPS及上游基因的表达,以全面分析穿心莲内酯代谢以及ApCPS在穿心莲内酯生物合成中的作用机制,验证其在植物体内的功能。结果显示:(1)ApCPS基因被成功沉默,基因表达显著下调,进而引起上游牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPS)的表达下调,而3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)的表达未受影响。(2)ApCPS基因沉默15d后穿心莲内酯积累量显著下降,表明ApCPS是穿心莲内酯生物合成关键酶基因,且能够负反馈影响上游基因表达。(3)茉莉酸甲酯(MeJA)显著诱导ApCPS及上游基因HMGR、DXS和GGPS的表达,表明穿心莲内酯生物合成基因受到MeJA的广泛调控。该研究首次使用VIGS证明ApCPS参与到穿心莲内酯生物合成,为利用该技术鉴定穿心莲内酯生物合成途径中其他基因功能奠定了基础。

川泽泻鲨烯合酶基因的原核表达研究

目的:构建川泽泻鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的原核表达载体。方法:在建泽泻SS基因序列的基础上,采用RT-PCR技术,从川泽泻新鲜叶片中克隆得到SS基因,并在BL21(DE3)细胞中分别用不同的表达载体、IPTG浓度、温度诱导该蛋白表达。结果:该基因在大肠杆菌中表达,但为包涵体,将其克隆到带有GST标签的pGEX-6t-1载体中进行原核表达并未改善蛋白溶解性;30℃诱导蛋白表达最佳;不同IPTG浓度对蛋白表达影响不大。结论:川泽泻的原核表达为后续对该基因的生物学功能及川泽泻品质改良奠定了基础。

人工老化对青川产北柴胡种子生理生化特性的影响

目的探究青川产北柴胡种子的劣变机制,揭示其不耐贮藏的原因。方法采用人工老化的方法处理柴胡种子,并分析老化过程中种子的抗氧化酶活性、电导率和营养物质量变化。结果随老化时间延长,老化种子的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化酶(CAT)活性持续下降;可溶性糖和可溶性蛋白的量降低,老化3 d后均处于低量水平;种子浸出液电导率下降;经老化处理1 d的种子即已丧失萌发能力。结论青川产北柴胡种子劣变机制包含氧化损伤、膜损伤和营养物质过度消耗3条途径,种子不宜长期贮藏,且贮藏要避免高温、高湿环境。

泽泻种质资源ISSR遗传多样性研究

目的建立泽泻ISSR分子标记的方法,对23份不同产地泽泻的遗传多样性和亲缘关系进行分析。方法采用ISSR分子标记技术和非加权平均距离法(UPGMA)对23份泽泻样品进行遗传多样性和聚类分析。结果从100条ISSR引物中筛选出35条多态性稳定、清晰的引物,在23份泽泻样品中扩增出172个稳定的扩增点,其中122个有多态性,多态位点百分率为70.5%。Nei's基因多样性(He)为0.4196,Shannon's信息指数为0.6081。结论 23个不同产地泽泻品种间多态性较高,但没有呈现明显的地域性差异。

穿心莲八氢番茄红素脱氢酶ApPDS的基因克隆及功能鉴定

采用RT-PCR和RACE技术从穿心莲植株中克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的全长c DNA,预测有一个1 752bp的完整开放阅读框(序列已登录Gen Bank,登录号KP982892),编码584个氨基酸。序列同源性分析,穿心莲PDS编码的氨基酸序列与芝麻、广藿香、黄芩等其他植物的PDS有很高的同源性,该蛋白包含一个共有的氨基酸脱氢酶的辅酶结构域NAD(H)-binding domain。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析,发现PDS基因在穿心莲的根、茎、叶、花中均有表达,表达量为叶﹥花﹥茎﹥根。用病毒诱导基因沉默(VIGS)的方法在穿心功莲体内鉴定Ap PDS的功能,构建VIGS载体p TRV2-PDS,经农杆菌浸染穿心莲叶片,植物表型观察、定量RT-PCR检测Ap PDS基因的表达,结果观察到叶片轻微变黄和明显的基因下调,鉴定了Ap PDS在体内的功能。该研究首次克隆并鉴定了穿心莲PDS基因,为进一步研究穿心莲中新基因尤其是穿心莲内酯类二萜生物合成基因的功能奠定了基础。

MAPK级联在玉米抗病反应和植保素代谢调控中的作用分析

利用MAPK级联抑制剂U0126和PD98059特异抑制MAPK信号传递途径后,使用禾谷镰刀菌侵染或脱落酸(ABA)处理玉米自交系Mo17幼苗,利用qRT-PCR分析植保素关键基因表达情况,观察MAPK级联对玉米响应禾谷镰刀菌侵染的情况。结果表明,抑制MAPK级联后,玉米叶片对禾谷镰刀菌侵染更加敏感,发病率显著提高,禾谷镰刀菌对植保素相关基因TPS6、An2、CYP71Z18、KSL5和TPS1的诱导受到抑制,且转录因子WRKY79的表达也被抑制,说明在玉米叶片中植保素的产生受MAPK级联的调控。玉米根系在MAPK级联被抑制后,ABA对这些基因表达的诱导同样受到抑制。说明MAPK级联参与植物抗病反应,在玉米叶片和根部MAPK级联可能通过调控转录因子ZmWRKY79参与对植保素代谢的调控,为玉米抗病反应机理研究提供理论依据。

水稻短链脱氢酶基因的表达及功能分析

植保素为重要的植物抗病防御代谢物,其生物合成需多种氧化酶参与。为研究短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase,SDR)基因在水稻植保素生物合成和胁迫响应中的关键作用,本研究从水稻基因组数据中得到与已报道的水稻SDR基因同源性较高的4个基因:OsSDR1、OsSDR2、OsSDR3、OsSDR4,利用RT-PCR技术成功克隆到这4个基因,并进行序列比对及系统进化分析;通过蛋白原核表达,除OsSDR1未检测到蛋白表达,OsSDR2、OsSDR3和OsSDR4均成功表达出蛋白;采用RT-qPCR检测4个基因的诱导表达模式,结果显示4个基因对逆境有不同的响应模式,表明其可能参与到不同的代谢途径。本研究为研究水稻中SDRs蛋白的功能,解析水稻植保素生物合成途径,探讨其在水稻抗逆中的作用提供了研究依据。