特发性室性早搏经射频消融后自主神经系统活性的变化

目的射频导管消融术(RFCA)是特发性室性早搏(IPVC)的标准治疗方法。本研究旨在确定低、中、高负荷量的患者在RFCA术前术后的自主神经系统(ANS)活动。方法回顾性分析2017年6月至2021年3月共200例特发性室性早搏行射频消融手术的患者。在200例患者中,179例(89.5%)手术消融成功。将消融成功的患者分为低负荷组(负荷量≤15%)、中负荷组(负荷量15%~25%)和高负荷组(负荷量≥25%)。评估不同负荷和不同消融部位患者的临床数据、心率变异性(HRV)各参数、窦性心率震荡(HRT)及心率减速力(DC)。结果高负荷组的平均心率、5 min均值标准差(SDANN)、正常RR间期标准差(SDNN)、正常RR间期标准差(SDNN)指数、逐次R-R区间差异均方根(rMSSD)、相邻RR间期差值超过50 ms的RR间期所占百分数(pNN50)高于低负荷组,而低频功率(LF)/高频功率(HF)之比低于低负荷组。消融后,SDNN、SDNN指数、SDANN、rMSSD、pNN50、震荡斜率(TS)和DC显著降低(P<0.01),LF/HF和震荡初始(TO)显著升高(P<0.01)。术前早搏负荷与左心室舒张末期内径(LVEDd)、平均心率、SDNN指数、SDANN、rMSSD、pNN50呈正相关,与总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、左心室射血分数(LVEF)、LF/HF呈负相关。回归分析显示,特发性室性早搏负荷与平均心率(P<0.01)、SDANN(P<0.01)和rMSSD(P<0.01)呈正相关。结论随特发性室性早搏负荷增加,交感神经和迷走神经活动增强,并以交感神经活性增强为主。特发性室性早搏的发生可能与自主神经平衡调节受损有关。射频消融术可降低交感神经和迷走神经活性。

抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体的制备和应用

目的:拟研制能特异性识别血浆中人血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide,VWFpp)的单克隆抗体,并且通过获得的抗VWFpp的单克隆抗体利用双抗体夹心法建立快速而可靠的检测血浆中VWFpp抗原的方法。方法:使用真核表达的重组人VWFpp(D1、D2区)蛋白作为免疫原,以常规方法免疫BALB/c小鼠,获取融合细胞的生长克隆,经过筛选和鉴定后,挑选能特异性分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,然后应用ELISA双抗体夹心法构建VWFpp抗原检测试剂盒,用于人血浆VWFpp的测定,对收集的12例行骨髓移植的白血病患者血浆进行VWFpp抗原水平动态检测。结果:最终获得两株可持续传代并分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并分别命名为SZ175和SZ176。经ELISA和Western blot鉴定,抗体能特异性识别VWFpp而不能识别成熟的VWF(不含前导肽)。利用双抗体夹心ELISA的原理,将单克隆抗体SZ175和SZ176成功制备成检测VWFpp抗原的试剂盒,动态检测白血病患者骨髓移植前后血浆中的VWFpp水平,结果显示移植后较移植前血浆中VWFpp水平有明显上升。结论:本研究成功制备两株抗VWFpp单克隆抗体,并且建立了VWFpp抗原双抗体夹心检测试剂盒,为进一步研究VWFpp的生物学功能以及血管性血友病临床诊断分型和内皮损伤相关疾病的预后监测提供了有力的工具。

氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子

目的:探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法:实验分为阴性对照组、阳性对照组(加组胺)、HDL、oxHDL 4组,ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL(10-120 mg/L)和组胺(1×10-9-1×10-4mol/L)处理不同时间(2-8 h)后,采用实时定量PCR(RQ-PCR)和Western bloting方法检测TF表达。同时,分别应用SP600125[c-Jun氨基端激酶(JNK)特异性抑制剂]、SB203580[p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)特异性抑制剂]、PD98059[细胞外信号调节激酶(ERK1/2)特异性抑制剂],观察其对oxHDL和组胺诱导的ECV304细胞表达TF的影响。结果:正常ECV304细胞未检测到TF,经组胺处理1 h后TF mRNA表达明显增加,在1×10-5mol/L时最高,约为1×10-9mol/L时的4.8倍。oxHDL以时间和浓度依赖性方式诱导ECV304细胞TF mRNA表达,在oxHDL20 mg/L时最高,为10 mg/L时的1.8倍,在第6 h时TF mRNA表达水平为第2 h的5.3倍(P<0.05),并在20 mg/L时显著刺激ECV304细胞TF蛋白表达,为40 mg/L时的1.5倍,而HDL没有此效应。MAPKs(JNK、p38 MAPK、ERK1/2)抑制剂可部分解除oxHDL诱导ECV304细胞TF表达的效应,TF分别下调表达至原来的19.0%、5.0%和13.0%(P<0.05)。结论:oxHDL能以浓度和时间依赖性方式诱导ECV304细胞产生TF,其机制可能通过JNK、p38 MAPK和ERK1/2所介导。

血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)单克隆抗体的鉴定以及生物学功能的研究

目的:构建并鉴定血管血友病因子裂解酶(ADAMTS13)单克隆抗体,并研究其生物学功能。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截断型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠,经标准单克隆抗体技术制备单克隆抗体。用ELISA方法鉴定单克隆抗体的特异性;应用免疫印迹技术确定单克隆抗体与全长ADAMTS13的识别能力;观察单克隆抗体对ADAMTS13水解v WF的影响。结果:最终获得6株抗ADAMTS13的单克隆抗体,克隆号分别为1G11、2F11、6G3、9E1、10A8、10B4。经ELISA鉴定,纯化后的单克隆抗体1G11和2F11的效价最高,与截断型ADAMTS13-T7蛋白结合能力比较,明显高于全长ADAMTS13蛋白。Western blotting结果显示,6个单克隆抗体都能与全长ADAMTS13结合,其中1G11和2F11条带最亮。功能实验表明,在变性条件下1G11和2F11能够明显抑制ADAMTS13水解v WF,并随着单克隆抗体浓度的增加而抑制作用增强。结论:成功获得针对ADAMTS13的单克隆抗体,其中两株为抑制性功能抗体。

人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

目的研制人血管性血友病因子(vWF)A1区的单克隆抗体及其生物学特性的鉴定。方法采用基因重组技术体外表达人vWFA1区蛋白(rvWF-A1),以rvWF-A1免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养,用ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。采用Westernblot和免疫组织化学方法进行单抗鉴定。结果构建了rvWF-A1表达载体pQE30-vWF-A1。rvWF-A1在大肠杆菌M15中稳定表达。通过融合、筛选获得两株阳性杂交瘤细胞,命名为SZ-129和SZ-130。其分泌的抗体能特异性地与rvWF-A1和人血浆中vWF结合。结论表达了rvWF-A1,并制备了具有潜在抗血栓作用的vWF-A1单克隆抗体SZ-129和SZ-130。

硼替佐米对内皮细胞株HMEC-1 VEGF基因表达的影响及其机制探讨

本研究探讨硼替佐米对内皮细胞株HMEC-1 VEGF基因表达的影响,并检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录调节活性和膜联蛋白A2(Annexin A2)表达强度的变化以分析VEGF基因表达变化可能的机制。用细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞的相对增殖活力;采用实时定量PCR检测VEGF基因表达强度,RT-PCR检测碳酸酐酶IX(CAIX)的基因表达强度,用实时定量PCR和Western blot分别检测Annexin A2在基因和蛋白水平的变化。结果表明:2.5、5.0、10nmol/L硼替佐米作用12小时,内皮细胞株HMEC-1VEGF基因表达强度分别为:0.730±0.106、0.673±0.153、0.767±0.090(0nmol/L时为1.0)(p<0.05);2.5、5.0nmol/L药物未明显抑制细胞的增殖活力(p>0.05),10nmol/L时细胞增殖则明显被抑制(p=0.024),不同浓度硼替佐米处理后,CAIX基因表达强度均明显降低,HIF-1α转录调节活性受到抑制;Annexin A2蛋白的表达也明显受抑。结论:低剂量的硼替佐米对蛋白酶体活性无明显抑制作用;硼替佐米可能通过调节内皮细胞HIF-1α的活性和Annexin A2蛋白的表达下调VEGF基因的表达水平。

Mer免疫球蛋白样区原核蛋白表达和单克隆抗体制备

目的利用原核蛋白表达载体,体外表达Mer的IgG样区,并利用此重组蛋白制备抗Mer的单克隆抗体。方法从K562细胞中抽提总RNA,利用RT-PCR扩增Mer的IgG样区片断。经过测序将所得片断与PQE30原核表达载体连接并转化到大肠杆菌M15中,挑选阳性克隆,经诱导和纯化后获得原核蛋白。利用所得的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对Mer的IgG样区的特异性抗体。利用ELISA方法筛选阳性克隆,Westernblot方法进行验证。结果体外成功表达MerIgG样区的原核蛋白,片断大小经修饰后约为26kd,表达量占菌体总蛋白的15%,经Ni-NTAagrose柱纯化后得到纯化蛋白并免疫Balb/c小鼠。将小鼠脾脏细胞和杂交瘤细胞融合后得到1株特异性抗MerIgG样区的单克隆抗体——SZ-128,Westernblot显示此单抗可以和表达的重组蛋白和Mer胞外区真核蛋白反应。结论成功制备1株抗MerIgG样区的特异性单克隆抗体,为研究Mer的功能提供了有力的工具。

Spacer区蛋白对ADAMTS13活性影响的研究

目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,收集超声上清并鉴定。并大规模诱导表达,利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化产品纯度和免疫学活性。利用重组蛋白与免疫性调节的血栓性血小板减少性紫癜(iTTP)患者血浆孵育,检测血浆中ADAMTS13的活性变化。结果:成功构建能表达spacer区的原核表达质粒并能有效表达蛋白。Western blotting结果显示,抗6×His抗体和抗人ADAMTS13抗体(针对Gln34-Trp688)分别能与重组蛋白在15 kDa处显单一条带。功能实验表明,该重组蛋白能够有效逆转iTTP患者中被自身抗体抑制的ADAMTS13酶活性。结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究spacer区对iTTP的发病机理提供了实验依据。

抗ADAMTS13单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的:建立分泌抗ADAMTS13单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备针对ADAMTS13不同结构域的单克隆抗体。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠。用ELISA方法测定免疫小鼠与ADAMTS13-T7蛋白的抗血清效价。取小鼠脾脏,制成单细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合,进行细胞的融合,并将杂交瘤细胞稀释培养。2周后选生长良好的克隆孔检测,阳性克隆孔扩大培养并再次检测。结果:获得真核表达截短型血管性血友病因子裂解蛋白酶ADAMTS13-T7蛋白纯品。利用真核表达的截短型ADAMTS13-T7蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA检测免疫后抗血清效价约为1∶20 000。利用杂交瘤技术通过融合,获得多株分泌抗重组ADAM TS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株。将其中的30株转入液氮中冻存,以备进一步分选及功能研究。结论:融合获得多株分泌抗重组ADAMTS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株,为进一步筛选出具有一定功能活性的单克隆抗体及研究ADAMTS13结构和功能提供更多的有力工具。

SiRNA沉默AnnexinⅡ对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖影响

目的观察沉默AnnexinⅡ（A2）基因对骨髓瘤RPMＩ8226细胞增殖影响。方法采用A2siRNA转染人骨髓瘤RPMＩ8226细胞后应用real-timePCR和流式细胞术鉴定干扰效果。MTT法检测A2siRNA对细胞增殖的作用。结果A2siRNA组较阴性对照组细胞生长抑制率在24h、48h、72h分别为16．87％±3．97％，34．92％±4．15％，39．62％±5．67％vs-8．93％±9．67％，-5．98％±2．56％，3．85％±5．48％（P〈0．05），A2siRNA可对RPMI8226细胞增殖起抑制作用。结论SiRNA沉默A2基因可抑制骨髓瘤RPMI8226细胞增殖。

人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的研制

目的研制人血管性血友病因子(von Willebrandfactor,vWF)A1区的单克隆抗体。方法采用基因重组技术体外表达人vWFA1区蛋白(rvWF-A1),以rvWF-A1免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养,用ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。Western blot方法进行单抗鉴定。结果构建了rvWF-A1表达载体pQE30-vWF-A1。rvWF-A1在大肠杆菌M15中稳定表达。通过融合、筛选获得一株阳性杂交瘤细胞1B10。该抗体Western blot显示能特异性地与rvWF-A1和人血浆中vWF结合。结论表达了rvWF-A1,并制备了具有潜在抗血栓作用的vWF-A1单克隆抗体1B10。

集合论的产生发展及其对数学教育的启示

集合及其运算是学生进入高中接触到的第一个新数学知识，这部分内容的教学将在很大程度上影响高中学生对于之后数学学习的态度和兴趣．同时，我国《普通高中数学课程标准（实验）》中指出：“集合语言是现代数学的基本语言，使用集合语言，可以简洁、准确地表达数学的一些内容”．

青藏高原东北部残积母质土壤发育过程研究——以青海湖北部宁夏剖面为例

残积母质是青海湖地区重要的成土母质之一,目前对高原残积母质土壤的研究相对匮乏,特别是其形成发育的年代尚不明晰,限制了对高原残积母质土壤演变过程的认识及对区域气候环境演变的理解。为探究青藏高原东北部残积母质土壤的发育过程及其发育模式,以青海湖北部宁夏(NX)剖面作为研究对象,通过光释光(Optically stimulated luminescence,OSL)测年获得残积母质土壤发育年代,采用化学蚀变指数(Chemical index of alteration,CIA)、Rb/Sr和粉黏比等探究土壤发育程度,对比青海湖地区河湖相沉积和黄土的Zr/Nb、K2O/Al2O3和TiO2/Al2O3分析其物源。结果表明:NX土壤剖面在早全新世以来发育,其年代结果集中在10.02~8.67 ka,成土母质发育时间与流域内风沙强烈活动时期基本一致,为干暖气候背景下的产物;通过物源对比分析,NX剖面底部母质为母岩就地风化而成,上部为风尘加积发育,发育模式为混合母质风尘加积型;剖面整体处于弱化学风化阶段,土壤发育程度较弱。

青海湖地区不同海拔黄土磁化率环境指示意义

青藏高原黄土蕴含丰富的古气候信息,但青海湖地区黄土中磁化率指示意义尚不明确,鉴于粒度指标意义明晰,对青海湖地区多个黄土剖面进行磁化率—粒度相关性研究,探究磁化率的指示意义,结果表明不同海拔磁化率存在差异:(1)低于3300 m时,磁化率和粒度对古环境指示作用较好,即气候暖湿,成壤作用增强,黏粒增加,强磁性矿物增加,磁化率升高,气候冷干时相反;海拔改变导致土壤环境变化,磁化率随海拔上升而增加。(2)高于3400 m时,粒度的古环境指示作用明确但磁化率不敏感,可能因为高海拔地区土壤易处于还原环境,强磁性矿物被溶解导致磁化率异常,磁化率随海拔上升而降低。

“互联网+”业态下中职电子商务教学的改革分析

受传统教学观念的影响,当前的中职电子商务教学存在较多问题,严重制约教学质量的提升,在“互联网+”时代背景下,中职电子商务教学改革势在必行。文章在深入分析中等职业教育特点的基础上,提出了“互联网+”业态下中职电子商务教学的改革对策,希望能对提升中职电子商务教学质量起到一定的积极作用。

基于光释光测年法的三江源地区高山草甸土形成年代与成因研究

[目的]分析三江源区高山草甸土壤的年代及发生发育过程,为维系该区土壤安全和生态安全提供指导。[方法]采用粗颗粒石英与钾长石光释光(OSL)测年法,对三江源区4个高山草甸土剖面夏琼(X_(Q))、歇武(X_(W))、桐勒栋(T_(LD))、斗地村(D_(DC))土壤的形成发育时间进行研究,结合土壤粒度、元素地球化学特征分析该区土壤形成过程。[结果]三江源区高山草甸土在末次冰消期至早全新世(13—8 ka)和晚全新世(3—0 ka)均有发育;4个土壤剖面分别在坡积母质和风积母质上发育而成,但其不同土壤发生层的元素地球化学特征与该区典型风成黄土一致。[结论]高山草甸土的发育集中在全新世期间,土壤的母质以坡积物和风积物的混合母质为主,风尘输入对于三江源地区的土壤形成意义重大,也是该区坡积物的原始物源,全新世气候相对干旱期的风尘释放对草甸土的形成意义重大。

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2(AnxA2)的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。方法利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠-小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白。结论该研究所获得的大鼠-小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障。

siRNA沉默AnnexinⅡ对淋巴瘤细胞系Jurkat细胞增殖和趋化能力的影响

目的观察沉默AnnexinⅡ（AnxA2）基因对淋巴瘤细胞系Jurkat细胞增殖、趋化能力的影响。方法应用实时荧光定量RT—PCR和流式细胞术鉴定小干扰RNA（siRNA）对人淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的转染效果，应用MTT法检测AnxA2 siRNA对Jurkat细胞增殖的作用，应用Transwell检测对细胞趋化能力的影响。结果AnxA2 siRNA干扰组在24、48、72h细胞生长抑制率分别为（17．4±2．3）％、（22．4±3．8）％和（37．6±1．5）％，与阴性对照组[分别为（-1．3±5．1）％、（-5．5±4．4）％和（-10．8±5．5）％]比较差异有统计学意义（P〈0．05），AnxA2 siRNA干扰对Jurkat细胞增殖起抑制作用；AnxA2 siRNA干扰组细胞趋化能力（11．3±4．2）显著低于阴性对照组（54．3±8．7，P〈0．01），AnxA2 siRNA干扰可显著降低细胞趋化能力。结论siRNA沉默AnxA2基因可抑制Jurkat细胞增殖、趋化能力。

Mer基因过表达对内皮细胞株HMEC-1细胞血管形成的影响及其机制探讨

目的探讨受体酪氨酸家族成员 Mer 基因对体外血管形成过程的影响及其具体作用机制。方法利用脂质体法将人全长 Mer 基因真核表达质粒转染到内皮细胞株 HMEC-1细胞中,G418筛选转染细胞得到阳性克隆,利用 PCR 和 Western blot 分别在 mRNA 和蛋白水平验证转染情况。利用Transwell 和 Matrigel 分别观察 Mer 基因过表达对于内皮细胞迁移能力和血管形成能力的影响。通过荧光定量 PCR 筛选血管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1、VEGFR-2基因的表达情况。结果经过 G418筛选后,PCR 和 Western blot 检测结果显示 Mer 基因在阳性克隆细胞中有较高水平表达,分别较空质粒对照组上升3.61倍和2.12倍;高表达 Mer 的 HMEC-1细胞迁移能力[迁移到 Transwell 下室壁的细胞为(21±6)/视野]较对照组[(36±11)/视野]明显下降。体外血管形成实验也表明高表达 Mer 基因的 HMEC-1细胞血管形成能力明显下降,抑制率为76.9%;荧光定量 PCR 结果显示 VEGF-C 和 VEGFR-2表达明显下降,VEGF-C 表达量为对照组的44.7%,VEGF-C 表达为对照组的25.6%。结论 Mer 过表达可以显著抑制 HEMC-1细胞的迁移能力和血管形成能力,并且可能是通过 VEGF-C/VEGFR-2信号途径发挥作用。

阻断血管性血友病因子与胶原结合的抗人vWF—A3单抗的鉴定和功能研究

目的制备阻断血管性血友病因子（von Willebrand因子）A3区（vWF-A3）与胶原结合的抗vWF-A3单抗，并对其进行生化鉴定和功能研究。方法用重组vWF-A3蛋白免疫BALB／c小鼠，经标准的方法制备单抗。用ELISA法鉴定单抗特异性，经vWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗，用免疫印迹技术确定单抗与重组（r）vWF-A3和还原性人vWF识别的抗原分子。经胶原结合试验确定单抗对vWF与胶原结合的影响。结果获得一组共30株抗vWF-A3单抗，其中两株确定为抑制vWF与胶原结合的单抗，分别命名为SZ-123和SZ-125，两株单抗分别与rvWF-A3和vWF强反应，而不与rvWF-A1、A2反应。免疫印迹分析显示SZ-123和SZ-125分别识别相对分子质量为27×10^3的rvWF-A3、250×10^3还原性人vWF单体和170×10^3的vWF酶切片段。单抗SZ-123和SZ-125不仅剂量依赖性地抑制纯化的人血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合，而且分别抑制人、猕猴或Beagle犬血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合。结论抗vWF-A3单抗SZ-123和SZ-125是两株抑制性单抗，有望成为具有治疗潜力的抗血栓药物。