重组凝血因子与血源凝血因子的分子差异及其对药理药效学的影响

重组凝血因子面世以来,在凝血因子缺陷和相关适应证患者中达到了良好的防治效果,已经开始替代血源凝血因子制品。然而,重组制品在免疫原性和抑制物产生方面的不足也受到关注。本文对几种主要的重组凝血因子与血源凝血因子的结构差异进行了综述,包括分子序列和翻译后修饰的多种形式等,并探讨这些结构上的差异对药理学、药效学和药代动力学的可能影响。这些分子差异和机制的揭示有助于探索和改进重组凝血因子的产量和质量,具有积极的临床治疗意义。

人α1-抗胰蛋白酶缺乏症的临床治疗及α1-PI规模化制备的进展

α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-proteinase inhibitor,α1-PI或α1-antitrypsin,α1-AT）是由肝细胞合成的1种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）,它最重要的生理功能是在肺内抑制弹性蛋白酶的活性[1]。1963年,Laurell和Eriksson[2]报道了遗传性α1-PI缺乏及其与患者早年（30~40岁）发生肺气肿的关系。

2007～2011年批签发管理制度下的血液制品供应状况

目的分析2007～2011年国内血液制品供应情况和供应特点,对未来血液制品市场供应做出评估,为建立血液制品供应信息管理化提供理论依据。方法从供应品种、批签发批次、生产数量、实际供应数量等多个角度考察2007～2011年我国人血白蛋白,人免疫球蛋白,静注人免疫球蛋白(pH4),人凝血因子Ⅷ等血液制品的批签发信息;分析中国血液制品市场供应情况。结果生物批签发批次从2007年不完全统计的800批次增长到2011年2 353批次,其中人血白蛋白供应量从2007年59.52吨增长到2011年182.93吨,2011年进口人血白蛋白达到78.22吨,占42.76%,国产达到104.71吨,占57.24%;人免疫球蛋白(肌注)2011年减少至183.6 Kg,约合61.2万瓶;静注人免疫球蛋白(pH4)(含冻干剂型)从2007年5.30吨增长到2011年14.15吨;破伤风人免疫球蛋白2011年供应为41 662万IU;狂犬病人免疫球蛋白2011年供应为49 432.3万IU;乙型肝炎人免疫球蛋白2011年供应为65 390.9万IU;其他血液小制品,2011年人纤维蛋白原供应69 901.5 g;2011人凝血酶原复合物供应为4 400.1万IU;2011年人凝血因子Ⅷ供应增长7 159.4万IU。结论施行生物制品批签发管理制度能使国家监管部门更准确地掌握生物制品的生产及质量情况,进一步保证血液制品的临床有效性,提高了血液制品的使用安全性。

从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。

亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究

目的探索通过免疫亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化人α1-抗胰蛋白酶浓缩物的方法。方法 24℃下,将Cohn氏法组份Ⅳ用Tris缓冲液抽提0.5 h后,离心4 750 g×15 min,上清液加入亲水型气相二氧化硅脱脂后,离心6 000 g×15 min,再用1.2μm的滤膜过滤;通过GE公司新型的Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和凝胶层析柱,对α1-抗胰蛋白酶进行纯化。用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;用SDS-PAGE鉴定α1-抗胰蛋白酶的纯度,并用Western Blot和串联质谱分析鉴定纯化的蛋白;通过发色底物法测定α1-抗胰蛋白酶活性。结果纯化的α1-抗胰蛋白酶在非还原性SDS-PAGE图谱上呈现1条54 kD左右的蛋白带和1条约140 kD的多聚体蛋白带,经过还原性SDS-PAGE多聚体条带解聚,Western Blot也可以反应相关变化;在经过前处理和亲和层析后,α1-抗胰蛋白酶活性回收率为(60.35±1.39)%,α1-抗胰蛋白酶总活性回收率为(41.88±6.98)%,纯化倍数为(71.68±1.32)倍,比活性大约(1.00～1.05)PU/mg。结论 GE公司Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和层析亲和层析可以从Cohn氏法组份Ⅳ中特异性捕获α1-抗胰蛋白酶浓缩物。

双特异性抗体介导的血液恶性肿瘤免疫治疗研究进展

癌症的免疫治疗研究近年来进展显著,通过将双特异性抗体(双抗)桥接、重定向并激活免疫效应细胞杀伤癌细胞,实现了令人瞩目的疗效。自2014年抗-CD19及抗-CD3的双抗blinatumomab获得美国FDA批准用于急性淋巴细胞白血病的治疗以来,重定向免疫效应细胞的双抗在血液恶性肿瘤的临床前和临床中的研究越来越活跃。本综述针对最常见的淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤和白血病3大血液恶性肿瘤,总结了B淋巴细胞、浆细胞和髓细胞不同的癌细胞抗原靶点双抗的科研和临床应用的进展。为了更好地使临床受益及降低毒副反应,寻找特异性更高的癌细胞抗原,优化抗原抗体结合的亲和力,延长双抗分子的体内半衰期,以及重定向不同种类的免疫效应细胞等研究还在持续地拓展,预期双抗介导的免疫疗法将会不断给血液恶性肿瘤带来突破和契机。

应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品（mAb1和mAb2）测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35～73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。