神经元猝死时神经介质的爆发性释放

本文应用了斑片钳技术研究了瓜蟾胚胎神经元释放神经介质的特性,尤其是支配肌细胞的神经元猝死时爆发性地释放出大量乙酰胆碱(ACCho)的特性.并进而研究了与此有关的肌细胞膜上乙酰胆碱受体通道的性质.本文还讨论了神经元猝死时神经介质的爆发性释放与癫痫等神经疾病相关的可能性.

大鼠下丘脑离体脑薄片视上核神经元的全细胞记录

在大鼠下丘脑薄片标本上对52例视上核神经元进行了全细胞膜片箝记录。膜被动及主动电生理参数测量如下：静息电位，59±8mV；输入阻抗，535±129MΩ；时间常数，32±9ms；动作电位幅度，99±11mV；超射值，37±13mV（n＝39）。大多数神经元在接受去极化刺激时出现明显的慢后超极化电位或电流。我们发现，在电压箱状态下几乎所有的视上核神经元均接受兴奋性和／或抑制性突触传λ（n=13）。药理学实验表明，兴奋性突触后电流是由non－NMDA亚型谷氨酸受体介导，而抑制性突触后电流由GABAA受体介导。

氧化乐果对烟碱样乙酰胆碱受体离子通道的阻断作用

在非洲爪蟾胚胎神经和肌肉细胞上，用膜片钳技术研究了有机磷杀虫剂氧化乐果对烟碱样乙酰胆碱受体（ｎＡＣｈＲ）离子通道的作用，发现它对自发微终板电流（ＭＥＰＣ）有双重作用，低浓度（８．６４μｍｏｌ·Ｌ－１）增加其幅度和频率，高浓度（３０．１６μｍｏｌ·Ｌ－１）则相反．６５９μｍｏｌ·Ｌ－１氧化乐果缩短通道开放时间，降低开放概率，对ｎＡＣｈＲ通道电流幅度和细胞膜钠，钾通道电流无影响．提示氧化乐果为ｎＡＣｈＲ离子通道开放阻断剂．本实验从分子水平上为有机磷杀虫剂对ＡＣｈＲ的直接作用提供了依据．

神经干细胞有丝分裂过程中nestin表达变化

在哺乳动物胚胎早期发育过程中 ,中枢神经系统的神经干细胞 ( NSCs)首先通过对称分裂进行自身复制 ,然后通过不对称分裂产生神经元和胶质细胞的前体细胞 ,这些细胞都表达一种中间纤维蛋白 ( IF) -神经巢蛋白 ( nestin)。nestin的表达是暂时的 ,一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元或胶质细胞 ,nestin则被其他中间纤维蛋白所取代。不同中间纤维在体内不同时期表达的原因和执行的功能还不清楚 ,但可以肯定的是 nestin与 NSCs的多潜能性有关。本实验通过缩时显微成像和免疫组织化学技术观察了 NSCs在对称分裂过程中 nestin的表达变化 ,发现 nestin在前、中、后、末四期的荧光强度表达有不同程度的变化 ,分裂前期与分裂间期相同 ,前中期荧光强度有明显增强 ,到中期荧光强度反而有些下降 ,到末期荧光强度达到最大值 ,胞质分裂后荧光强度逐渐下降。这种波动表达现象将有助于揭示

培养的新生大鼠交感神经元膜电学性质及电压门控通道的膜片箝研究

在培养的新生大鼠颈上神经节交感神经元标本上，用全细胞电流箝及电压箝技术观察记录了交感神经元膜电学参数及电压门控性通道电流。用全细胞电流箝测得下列平均值：静息电位，－５１±６ｍＶ；输入阻抗，１４３２±３８９ＭΩ；时间常数，１３０±３２ｍｓ；动作电位幅度，９６±１０ｍＶ，超射值，４２±６ｍＶ。培养早期即可记录到自发或诱发的动作电位，大多数动作电位后跟随快或慢的后超极化电位。在电压箝状态下可分别记录到电压门控钠、钾、钙通道电流。钾电流以延迟整流型为主，钙电流只有高电压激活，缓慢失活的Ｌ或Ｎ型，未能记录到低电压激活，快速失活的Ｔ型钙电流。

五味子乙素抑制海马神经元网络自发同步钙振荡

五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是传统中药五味子的主要活性成分之一,文章利用体外原代培养的海马神经元网络作为实验模型,研究Sch B对神经元网络功能的调控作用。实验结果表明:Sch B对神经元网络自发同步钙振荡有显著抑制作用,且呈浓度依赖,IC50=1.61±0.11 mg/L。提示Sch B能够有效调节突触终末自发递质释放、调节神经元网络兴奋性、具有神经保护性。

胰岛素样生长因子1对β样淀粉蛋白引起的神经元凋亡和tau蛋白磷酸化的作用(英文)

本研究的目的是阐明胰岛素样生长因子1(IGF-1)对β样淀粉蛋白(Aβ)引起的神经元凋亡的保护作用,以及tau蛋白磷酸化的作用。用MTT(四甲基偶氮唑盐)方法检测细胞活性,用流式细胞学结合Annexin V-FITC和PI(碘化丙锭)双染的方法检测早期凋亡和晚期凋亡/坏死,用Hoechst 33342染色观察凋亡细胞形态学,用免疫细胞化学的方法检测tau蛋白磷酸化。IGF-1阻止了Aβ25-35引起的培养的大鼠海马神经元的毒性,MTT值显著增加,从54.51%增至61.8%,Hoechst 33342阳性细胞的百分比从30.77%减少到22.81%。Aβ25-35孵育使Annexin V单标记细胞(Annexin V+/PI-)以及Annexin V/PI双标记细胞(An-nexin V+/PI +)的百分比显著增加(分别为3.41%和19.47%),应用100 ng/ml的IGF-1可显著减少Annexin V单标记细胞和Annexin V/PI双标记细胞的百分比分别至2.98%和15.16%。Aβ25-35可增加tau蛋白磷酸化,AT8阳性细胞占41.84%,而IGF-1则可抑制这一效应。我们的结果表明IGF-1可保护神经元,降低Aβ的细胞毒性,减少早期和晚期凋亡/坏死细胞的比例,抑制tau蛋白磷酸化,这可能是IGF-1神经保护作用的细胞机制。

Wistar大鼠SONIC HEDGEHOG基因的克隆和表达

为了获得SHH蛋白以研究它在治疗神经变性疾病中的作用 ,本室提取不同胚龄Wistar胎鼠中的总RNA ,应用RT PCR技术获得SHH N的cDNA ,重组于pGEM T载体 ,经测序鉴定后 ,构建原核表达质粒并获得表达菌株Q15 SHH N ,然后诱导SHH蛋白的表达。结果发现 ,在E11.5 E2 0 .5胎鼠的脊索中能克隆到 6 30bp的cDNA片段 ,并且随胚龄增加 ,此片段的表达量逐渐减少 ;测序结果显示 ,此片段及其所编码的氨基酸序列同数据库中人、小鼠和SD大鼠的SHH N的序列有较高同源性 ;表达菌株经诱导后产生约 2 1kD的融合蛋白。提示SHH N是一种发育相关基因 ,在不同种属中的同源性较高 。

新化合物三环哌酯的抗N和M胆碱受体作用

三环哌酯盐酸盐（ＴＣＰＮ·ＨＣｌ）和碘甲烷盐（ＴＣＰＮ·ＣＨ３Ｉ）为新化学实体。本文以烟碱诱发小鼠惊厥，豚鼠回肠收缩为评价中枢和外周神经元性Ｎ受体功能的指标，以槟榔碱诱发小鼠震颤为评价中枢Ｍ受体功能的指标，并在肌细胞上进一步观察药物对Ｎ受体离子通道的影响。结果表明，ＴＣＰＮ·ＨＣｌ使烟碱诱发小鼠惊厥的量效曲线平行右移；并对抗槟榔碱诱发小鼠震颤的作用，也可对抗烟碱诱发回肠收缩，阻断神经肌肉接头处自发微终板电流，并优先阻断开放时间长、电流强度大的Ｎ受体离子通道。提示ＴＣＰＮ·ＨＣｌ有强效抗中枢Ｎ和Ｍ受体作用。

IGF-1对海马神经元抑制性突触传递的影响

目的：观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对原代培养海马神经元抑制性突触传递的影响并探讨其可能机制。方法：采用无血清培养基培养海马神经元,在10～14d时用于实验。电生理实验分为正常对照组和IGF-1处理组（实验前24h加入IGF-1,终浓度为10μmol/L）。细胞免疫化学实验分为正常对照组、IGF-1处理组和MAPKS转导通路抑制剂（PD98059）预处理组（IGF-1处理前1h加入PD98059,终浓度为10μmol/L）。采用全细胞膜片钳记录方法观察IGF-1对抑制性突触后电流（IPSC）的影响,用细胞免疫化学方法观察其对γ-氨基丁酸能细胞数目影响。结果：IGF-1能够显著降低IPSC的频率,但与对照组比较其幅度差异无统计学意义;IGF-1能够明显减少GABA阳性细胞数目,应用PD98059后可阻断这种作用。结论：IGF-1的上述作用可能参与海马对学习记忆功能的调节过程。

有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用

在非洲有爪蟾蜍胚胎神经和肌肉细胞上，用膜片钳技术研究了有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）通道的作用，发现它对自发微终板电流（ＭＥＰＣ）有双重作用，低剂量（２１．６μｍｏｌ／Ｌ）增加其幅度和频率，高剂量（２３７μｍｏｌ／Ｌ）则相反。１４６μｍｏｌ／Ｌ乐果缩短通道开放时间降低开放概率。对ＡＣｈＲ通道电流幅度和细胞膜钠、钾通道电流无影响。提示乐果为ＡＣｈＲ通道开放阻断剂。本实验从分子水平上为有机磷杀虫剂对ＡＣｈＲ的直接作用提供了依据。

新型抗胆碱药物盐酸戊乙奎醚及其4种光学异构体对N受体离子通道的作用

在非洲爪蟾培养的胚胎神经元和骨骼肌细胞上，本文采用细胞膜片钳技术，研究新型抗胆碱能药物盐酸戊乙奎醚（ＰＨＣ）及其４种光学异构体对骨骼肌细胞Ｎ受体离子通道的作用．结果表明ＰＨＣ可阻断神经肌肉接头乙酰胆碱传递；其４种光学异构体与之相比在对抗强度上无明显差别．ＰＨＣ优先阻断开放时间长、电流强度大的Ｎ受体通道．此外。

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)进行了研究,结果表明:(1)新分离的正常OHC呈柱状,胞膜先滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,4小时内形态无明显变化.(2)全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,OHC膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成.(3)利用全细胞记录方式得到的OHC静息电位值为-26±9mV((?)±SD,n=10).

人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 。

神经前体细胞的增殖和分化及其对Parkinson病的治疗作用

本实验分离 1 1～ 1 5 d胎鼠的大脑皮层 ( CP)和中脑的神经前体细胞 ( MP) ,观察它们在体外的增殖和分化及其对帕金森病 ( PD)的治疗作用。结果发现 ,CP较 MP生长迅速 ,容易形成神经球 ,加入 N2 / B2 7有助于神经球的形成 ;有 /无血清分化后 ,CP和 MP都能发育成微管相关蛋白 -2 ( MAP-2 )阳性细胞 ,其中 MP倾向于发育成酪氨酸羟化酶 ( TH)阳性细胞。将 MP或 CP植入6 -OHDA损伤的大鼠纹状体后 ,MP发育成的 TH+神经元数量明显地较 CP移植组和对照组者多 ( P<0 .0 5 )且 MP移植后 4～ 8周旋转行为发生明显改善 ,与 CP移植组和对照组相比有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。上述结果提示 ,虽然 CP在体外的增殖能力较MP强 ,但 MP更易于分化成 TH阳性神经元并改善 PD大鼠的旋转行为 ,此点对于神经前体细胞治疗 PD的应用极其重要。

大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究

为了获得重组SonichedgehogN端蛋白 (Shh N)并研究其功能 ,应用PCR技术扩增Shh NcDNA ,然后克隆至原核表达质粒中 ,转化E .coli后获得表达菌株 ,经 1mmol/LIPTG诱导高效表达出带有His tag的融合蛋白 ,其中大部分为可溶性蛋白 ,少量为包涵体 .用His tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带 ,凝胶自动扫描分析表明 ,Shh N的纯度达 85%以上 .纯化后的Shh N在成纤维生长因子 8(FGF8)的协同作用下 ,能诱导神经前体细胞 (NPC)向酪氨酸羟化酶阳性神经元 (TH+ )发育 .在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺 (DA)神经元 ,从而为临床治疗帕金森病 (PD)

Capsazepine抑制培养海马神经元网络线粒体转运(英文)

capsazepine(CZP)是辣椒素的合成类似物,也是野香草型瞬时感受器电位通道1(TRPV1)的选择性抑制剂。TRPV1在体内有广泛的表达谱,使CZP有广泛的作用位点。除此之外,以往的研究结果表明CZP除了作用于TRPV1外还有更复杂的信号通路。本课题研究了CZP对体外培养的大鼠海马神经元网络内线粒体转运的作用并分析其可能机制。结果显示:20μmol/L的CZP可有效抑制原代培养海马神经元网络中的线粒体转运。CZP急性作用不引起胞内钙离子浓度的升高,也不引起细胞的调亡。胞外更换为无外钙记录液,或者将GSK3β抑制剂SB415286与CZP共孵育,均不影响CZP对线粒体转运的抑制作用。然而,将BAPTA-AM与CZP共孵育,抑制了CZP对线粒体转运的抑制作用。本研究结果表明,CZP直接通过胞内钙信号通路影响神经元的线粒体转运,与胞外钙流或转运蛋白的磷酸化无关。

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .

爪蟾胚胎脊髓胆碱能神经元上两类非去极化激活的钙通道

用膜片箝方法,在标定的爪蟾胚胎脊髓胆碱能神经细胞膜上记录钙离子单通道电流。结果显示,在静息膜电位时钙通道即有开放活动。根据通道的电导及动力学等特性,我们将其分为两种类型:NS 型钙通道,斜率电导7.5pS,静息膜电位时平均开放时间0.58ms,其活动受牵张膜片的影响;NL 型钙通道,斜率电导16.7pS,静息膜电位时二级平均开放时间分别是2ms 和19.3ms。鉴于它们在膜静息以及负电位相的显著活动,我们推测这两类钙通道可能参与神经元静息膜电位时钙依赖的细胞活动过程。

核受体相关因子1的研究进展

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,主要表达于中脑黑质与腹侧被盖区 ,作为基因转录调控蛋白而参与了中脑多巴胺能神经元的发育与存活、长时记忆、肝再生及炎症等多种生理和病理过程。本文总结和讨论了有关Nurr1的编码基因、分子结构。