苏云金芽胞杆菌6618杀虫菌株的分离和鉴定

从我国不同地区采集118份土样,利用温度筛选法分离获得一株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)6618,镜检观察发现该菌株能产生典型的菱形晶体,PCR分析表明其含有cry1类杀虫基因。采用SDS-PAGE和质谱分析发现该菌株主要产生130 k D原毒素,其组分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成。基因序列分析表明该菌株的cry1Ac基因为已知的cry1Ac1,而cry1Ae为新型杀虫基因。毒力生测表明该菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有显著的杀虫效果。筛选获得的高毒力Bt菌株6618为丰富我国苏云金芽胞杆菌储备和研发新型高效生物杀虫剂提供了菌株资源。

苏云金杆菌Bt4.0718不同时期比较转录组揭示芽胞和杀虫伴胞晶体形成机制

【目的】苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在形成芽胞的过程中产生大量杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs),是目前应用最广泛、最安全的微生物杀虫剂的主要菌株资源。本研究旨在比较Bt 3个重要时期的转录组,进一步探究芽胞和杀虫伴胞晶体的形成机制,为高效工程菌的构建奠定理论基础。【方法】选取高毒力Bt4.0718菌株营养生长中期(T1-10h)、芽胞形成前期(T2-20 h)、芽胞形成后期(T3-32 h)进行比较转录组分析,对代表性差异基因进行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)验证、特定功能基因的敲除和表型分析验证。【结果】差异表达基因数量分别为2147个(T2/T1)、1861个(T3/T1)、1708个(T3/T2)。T1时期,培养基中营养相对丰富,主要为芽胞和杀虫伴胞晶体形成做准备。芽胞形成重要调控基因kinA/D、spo0A/F、sigE高水平转录对菌体的生长发育具有重要作用,Cry1Ac、碳源、能源贮藏物聚-羟基丁酸(poly-hydroxybutyric acid,PHB)和羟基丁酮(acetoin)也已开始转录。芽胞和ICPs的大量形成在T2和T3时期,相关基因的转录水平T2比T3时期高。T2对比T3时期,芽胞核/衣/皮质(spore core/coat/cortex)、芽胞萌发受体蛋白(germination protein)和芽胞形成的Ⅱ-Ⅵ阶段相关基因(spoⅡ-spoⅥ)在T2时才开始大量转录,为3个时期的最高水平;相应的糖类、氨基酸、脂质代谢,能量、核酸、多肽代谢、次级产物生成和环境适应系统等复杂网络均表现出差异;另外,作为营养信号刺激性生理过程,双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCS)和ABC转运系统在芽胞形成和ICPs的转录表达过程中发挥重要作用,转录水平具有显著差异。【结论】随着芽胞和杀虫伴胞晶体的形成,营养成分逐渐匮乏,sigB、sigW和sigM的高效表达有助维持细胞壁的稳定和对环境变化的抗性;小热激蛋白Hsp20和Hsp20B作为分子伴侣蛋白对维持胞内稳态也十分重要,T2、T3时期高水平转录可能有助于芽胞形成和ICPs表达。

苏云金芽胞杆菌杀虫毒素的挖掘与分子改造

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)制剂是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂,其杀虫组分是在芽胞形成过程中产生的伴胞晶体。由于Bt杀虫制剂目前依然存在见效较慢、毒力有待提高、害虫产生抗性等方面的不足,从而影响了Bt制剂的进一步大规模推广和使用。为了克服Bt制剂存在的问题,笔者通过挖掘新的杀虫毒素以及通过改造现有的杀虫基因等方式来获得新的杀虫菌株和基因资源。为了更快地筛选新型Bt菌株以及杀虫晶体蛋白,笔者建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法,即将Bt菌株产生的晶体蛋白混合物包埋于聚丙烯酰胺凝胶块中,结合LC—MS/MS分析胶内酶解产生的复合肽段,以快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。利用该方法笔者发现了多种新型杀虫毒素。目前普遍认为,Cry1类原毒素的C-端区域对伴胞晶体的溶解性及其在昆虫中肠道的毒力有重要影响。由于Cry2类原毒素形成的方形晶体在中肠道内溶解性较差,笔者利用Red/ET同源重组技术构建了Cry2Aa原毒素与Cry1Ac的C-端区域形成的融合蛋白,分析融合蛋白的表达情况及杀虫毒力,结果表明Cry1Ac原毒素的C-端区域能够增强Cry2Aa晶体的溶解性及其在昆虫中肠道的毒力。同时,为了分析Cry1类原毒素C-端区域保守的Cys残基的功能,笔者利用丝氨酸扫描突变对Cry1Ac原毒素C-端区域的14个Cys残基进行单点及叠加突变。通过扫描电镜观察发现,野生Cry1Ac能够形成典型的菱形晶体,突变Cry1Ac也能形成菱形晶体,但是菱形晶体的长度变短,其中,14个Cys残基全部突变的晶体长度最短。毒力生测结果表明,突变晶体对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的毒力明显高于野生晶体。