重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。

曲酸生产菌的复合诱变选育

以生产菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)w-56为出发菌株,经2次紫外线、2次60Co多重复合诱变处理,选育获得曲酸生产菌UR28,生产发酵周期由原来的130h缩短至65h,曲酸产量由原来的36g/L,提高到68g/L,比出发菌株提高了88.9%。实验证明采用复合诱变,能有效改变菌株对诱变因素的敏感性,提高突变率,逐步提高突变株的产酸水平。

HPLC检测发酵液中二羟基丙酮和甘油的含量

应用高效液相色谱法检测发酵过程中发酵产物二羟基丙酮和底物甘油浓度。在流动相乙腈、纯净水的比例为85∶15(v∶v),流速为1mL/min,色谱柱为Hedera-NH2的条件下,用紫外检测器在271nm处检测DHA,用示差折光检测器检测甘油。高效液相色谱法检测DHA的线性范围为2.0-12.0mg/mL,相关系数(r)为0.9996,检测甘油的线性范围为0.1-1.0mg/mL,相关系数(r)为0.9998。该方法应用于二羟基丙酮发酵过程中底物和产物的检测,该方法不受培养基中不同碳源(葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、甘油),不同氮源(蛋白胨、酵母膏、酵母粉、营养肉汤)以及菌体未完全利用的培养基成分、菌体生长过程中产生的其它代谢产物的影响,该方法具有较好的通用性。

HPLC法测定猪尿酸酶活性

建立了一种测定重组猪尿酸酶活性的高效液相色谱方法。将重组猪尿酸酶基因工程菌的粗酶液与尿酸溶液反应5min,加入高氯酸溶液终止,经超滤后以体系中尿酸浓度的降低值为指标,采用HPLC法[色谱条件:AgilentZorbax 300SB-C18色谱柱、流动相为磷酸-甲醇-双蒸水(3∶25∶472,体积比)、流速1.0mL·min-1、波长292nm]测定粗酶液活性。结果表明,尿酸在10～500μmol·L-1范围内线性关系良好,样品回收率在99%～104%之间。该方法不受杂质干扰、稳定、灵敏度高,适用于尿酸酶粗酶液活性的检测。

重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

目的构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定。方法从pET-22b/pUOX重组质粒上PCR获得pUOX基因,然后通过重叠延伸PCR技术将pUOX与一段nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌WB800中。结果发酵表达后胞外分泌液经SDS-PAGE检测,在约34kD处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。发酵液中该重组蛋白的酶活力达2.322U/ml。结论成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的蛋白分泌表达并具有较高活性。

初中数学教学中数学思想方法的渗透教学

在当前的数学教学过程中,对于数学思想方法的重视已经上升到了新的高度。对于初中数学的学习,知识的积累和理解是表象,最重要的是学习数学的精髓,而数学的精髓便是——数学的思想方法。教师需要从数学的教学工作出发,有效培养学生的数学综合素养,并指导学生领会数学思想方法的内核,这样学生才能有效应用知识,最终形成实际解题能力。

初中数学函数教学探究

在素质教育蓬勃发展的当下,初中时期对于学生来说是极其关键的,不仅是学生性格和学习习惯养成的关键时期,还是他们价值观和人生观形成的重要阶段,但该阶段的学生大多拥有叛逆心理,所以初中数学教师在进行函数的教学时,要让学生在课堂中感受到激情与精彩,以此来提高他们的专注度。本文将结合笔者多年初中数学教学经验,对初中数学函数教学探究做逐一深入阐述,为广大教育工作者解疑答惑。

人尿酸氧化酶进化机制研究

尿酸氧化酶(尿酸酶;EC1.7.3.3;UOX)是一种在嘌呤代谢途径中催化尿酸氧化生成尿囊素的酶。在灵长类动物漫长的进化过程中,人科动物尿酸氧化酶基因因突变失活,成为假基因。通过来源于10种不同生物尿酸氧化酶蛋白质序列比对,鉴别出发生在人科动物的共同祖先的尿酸氧化酶基因上的3个能够引起尿酸分解活性降低甚至丧失的初级突变位点以及发生在人尿酸氧化酶基因上的12个次级突变位点,同时运用定点突变技术对发生在人科动物共同祖先尿酸氧化酶基因上的初级突变位点进行了验证研究。根据这15个突变位点在人科动物尿酸氧化酶基因上出现的频率和灵长类动物的物种进化分支树,判断出上述突变位点在人尿酸氧化酶基因上发生的先后顺序,最终阐明了人尿酸氧化酶的进化轨迹。