一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法

目的:建立一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法。方法:取新生大鼠、成年小鼠的肝组织,立即剪碎、铜网过滤,RPMI-1640培养基培养,24小时后换液,除去血细胞后进一步培养,形态学观察,并用PAS(periodicac-id-Schiff)染色法鉴定。结果:在光镜可见分离、培养的肝细胞折光性强,呈圆形,偶见梭形,核大而圆,具有双核细胞;PAS染色后,胞质中布满粉红色糖原颗粒,核呈空泡状。结论:本实验方法可获得较纯的肝细胞,而且操作简便可行,经济实用。

肝细胞简易分离、培养和鉴定方法初探

长期以来,Guguen等[1]的两步胶原酶灌注法分离获得肝细胞的方法,几乎成了肝细胞分离的经典方法;在此基础上又发展了多种不同的培养方法,如在培养瓶内加纤连蛋白(febronectin)以促进肝细胞附壁[2],添加生长因子于培养基促其生长等.但上述方法步骤繁琐,成本较高,且两步胶原酶灌注法主用于大鼠肝细胞的分离,不适于新生鼠肝细胞的分离,甚至分离成年小鼠肝细胞,都因为血管的纤细,在实际应用中也很困难.

不同剂量胰岛素对缺血再灌注肾组织的影响

目的 :观察家兔肾缺血再灌注 (ischemicreperfusion ,IR)过程中 ,外源性胰岛素对肾组织功能和超微结构的影响。方法 :日本大耳白兔分为 :对照组、单纯缺血再灌注组 (IR组 )、胰岛素处理组 (Ins +IR组 ) 3组 ,Ins +IR组再灌注的同时给予胰岛素溶液 (Ins 3IU ,6IU ,12IU/kg.wt) ,对照组和IR组则给予等量生理盐水。分别观察 3组动物缺血再灌注 2h、4 8h时 ,血清尿素氮 (BUN)含量变化 ,以及肾组织结构改变。结果 :肾缺血再灌注 4 8h ,IR组血清BUN较对照组显著升高 (P <0 .0 0 1) ,而小剂量胰岛素组与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;中剂量胰岛素组血清BUN仍显著高于对照组 (P <0 .0 0 1) ,大剂量胰岛素组BUN比IR更高 (P <0 .0 5 )。光镜及电镜结果显示 ,对照组结构未见异常 ,IR组肾组织呈变性和坏死改变 ,小剂量胰岛素组肾组织轻度变性 ,中、大剂量胰岛素组与对照组结构改变类似。结论 :外源性小剂量胰岛素具有抗家兔急性缺血再灌注性肾损伤的作用。

线粒体显示法

作者对Regaud氏线粒体染色法进行改良,满意地显示了培养心肌细胞、平滑肌细胞的线粒体。该法简便,不需要特殊染料,可用于细胞线粒体的形态学研究和批量教学切片的生产。

槲皮素对LPS延迟中性粒细胞自发性凋亡效应的抑制作用

目的 :研究槲皮素对接受细菌脂多糖 (LPS)刺激的中性粒细胞 (PMN)自发性凋亡的影响 ,探讨槲皮素的抗炎作用机制。方法 :以人外周血PMN为研究对象 ,选择光镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况 ,对裂解的片段化DNA进行定量 (二苯胺测定法 )和定性 (琼脂糖凝胶电泳 )分析。结果 :槲皮素 (1～ 10 0 μmol/L)对PMN的自发性凋亡率并无影响 ,但却能部分恢复由LPS所延迟的PMN自发性凋亡进程。当槲皮素的浓度为 4 0 μmol/L时 ,其恢复作用达到最大。 结论 :槲皮素对LPS延迟PMN自发性凋亡的效应产生了抑制作用 ,减轻了因预激因子活化PMN而加重的炎症反应 ,部分揭示了槲皮素的抗炎作用机制。

槲皮素对LPS诱导的中性粒细胞产生白介素6的影响

目的研究离体培养的人中性粒细胞在被LPS激活的情况下,槲皮素对中性粒细胞产生IL-6的影响。方法运用ELISA法检测槲皮素对LPS诱导的中性粒细胞分泌IL-6的影响;运用流式细胞术检测槲皮素对LPS活化的中性粒细胞内IL-6的蛋白水平的影响;运用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测槲皮素对LPS活化的中性粒细胞表达IL-6 mRNA的影响。结果在无刺激的情况下中性粒细胞不产生IL-6,LPS(1μg/mL)以时间依赖性的方式诱导中性粒细胞表达IL-6 mRNA,合成并分泌IL-6,并在16 h达到高峰。然而,预先用槲皮素(40μmol/L)处理中性粒细胞30 min后,LPS诱导的中性粒细胞表达IL-6 mRNA,合成并分泌IL-6则受到了抑制。结论IL-6是炎症早期重要的促炎症因子。因此,槲皮素抑制LPS诱导中性粒细胞产生IL-6,提示槲皮素可能通过对炎症因子负性调控而发挥其抗炎作用。

ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的形态学变化

目的研究前列腺素E受体亚型3(EP3)激动剂ONO-AE-248诱导的中性粒细胞(PMN)非凋亡性程序化细胞死亡的形态学变化,探讨PMN死亡形式的多样性和复杂性。方法运用透射电镜、荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜观察PMN在自发性凋亡与ONO-AE-248刺激下亚细胞微结构的变化。结果以5mmol/L的ONO-AE-248刺激PMN12h后,电镜观察绝大多数PMN的多叶核融合为单叶核,核质疏松,核膜分层、起泡甚至破裂,核质溢出,但细胞膜较完整,细胞器无明显改变。以荧光染料DAPI标染活细胞核,ONO-AE-248刺激后,PMN表现为多叶核融合成大而模糊的球形,核染色密度较低;ONO-AE-248刺激的PMN死亡仍有细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻。ONO-AE-248刺激组与自发性凋亡组PMN在线粒体的形态结构、分布和细胞质内的染色性均有明显差异。结论ONO-AE-248在体外能刺激人PMN发生非凋亡性程序化细胞死亡,这一刺激过程不影响自发性凋亡的PMN细胞膜PS的外翻,并且细胞核和线粒体的改变是其早期最为显著的形态学改变,提示二者可能是ONO-AE-248刺激的靶标和早期的药物反应中心。

ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的生化信号转导初探

目的:研究ONO-AE-248诱发中性粒细胞(PMN)非凋亡性程序化细胞死亡过程中,细胞死亡相关的蛋白分子caspase-3、caspase-8、p-38MAPK和PKC的作用,探讨这种细胞死亡的分子机制。方法:运用光镜和DNA电泳对PMN形态学变化和生化特征进行观察和评估;通过Western blot显示PMN中caspase-3、caspase-8活性改变和p-38MAPK磷酸化改变;运用MTS法检测PKC抑制剂对PMN活性的影响。结果:PMN经ONO-AE-248刺激,绝大多数分叶核融合成单叶核(12小时),DNA琼脂糖电泳结果显示缺乏梯状条带(24小时),而且ONO-AE-248对caspase-3、caspase-8活性和p-38MAPK磷酸化水平无明显影响。然而,PKC抑制剂STS和H-7能显著抑制ONO-AE-248对PMN的促死亡效应。结论:ONO-AE-248所诱导的PMN死亡可能是一种非凋亡性的主动性细胞死亡,即非凋亡性程序化细胞死亡。该死亡过程不依赖caspase-3、caspase-8的活化和p-38MAPK的磷酸化,但是PKC可能发挥正向的调控作用。

ONO-AE-248诱发线粒体膜势能降低导致中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡

目的研究线粒体在ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡中形态结构及功能的变化情况,为进一步确立这一新的死亡形式和找寻其独特的死亡信号转导途径提供实验依据。方法体外新鲜分离人外周血中性粒细胞与ONO-AE-248共同培养,流式细胞术检测其线粒体膜势能的变化;激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体形态结构和分布情况。结果ONO-AE-248迅速导致中性粒细胞线粒体膜势能的溃散;ONO-AE-248刺激后中性粒细胞在线粒体形态、结构、分布和胞浆内染色特性等方面均与阴性对照有明显差异。结论线粒体变化是ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡早期形态学上区别于凋亡的显著变化之一。线粒体膜通透性转变以及线粒体膜势能下降可能是ONO-AE-248诱导的非凋亡性程序化细胞死亡的主要原因。

Mcl-1和Puma在宫颈癌组织中表达的初步研究

目的探讨新的凋亡抑制基因Mcl-1在宫颈癌组织中的表达及其与Puma表达的相关性。方法应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法,检测Mcl-1和Puma基因在10例正常宫颈组织及46例宫颈癌组织中的表达。结果 Mcl-1在10例正常宫颈组织中表达较低。46例宫颈癌组织中,40例Mcl-1表达强阳性,占80.7%。Puma的表达仅13例,占32.5%。基因表达阳性率与宫颈癌的病理分级和临床分期有关,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Puma和Mc-1参与了宫颈癌的发生、发展,并且两者在癌组织中的表达可能存在某些相关。

正常人胆管壁组织构筑的研究

对5例正常人胆道系统的组织构筑及平滑肌、弹性纤维、胶原纤维的分布进行了面积计量研究.从胆总管胰后段至左右肝管汇合部,平滑肌的面积分数从13.56±0.65%降至3.34±0.32%,弹性纤维的含量以肝总管和左右肝管汇合部为高,与胆总管胰后段和十二指肠上段比较,差别有显著性.胶原纤维的含量在肝外胆管各段之间和肝内胆管各段之间无显著差异,但肝内胆管与肝外胆管之间的差异显著.肝内与肝外胆管壁的组织构筑存在一定的差异,说明它们的生理功能有所不同.

体外培养的高血压病动脉平滑肌细胞端粒酶活性检测及其在发病学上的意义

目的:探讨体外培养的高血压病动脉平滑肌细胞端粒酶活性与高血压的发病关系。方法:采用PCR-ELISA法检测10例高血压病患者和8例血压正常者体外培养的肠系膜动脉平滑肌细胞(SMC)端粒酶活性。结果:10例高血压端粒酶阳性表达9例,阳性率90％。对照组血压正常病人8例,端粒酶阳性表达2例,阳性率25％。差异有显著性(P<0.05)。结论:体外培养的高血压病动脉平滑肌细胞有端粒酶活性的表达,端粒酶活性可能与高血压发病有关。

神经细胞体外分离培养的比较研究

目的:对神经元分离、培养的不同实验方法进行比较研究。方法:取成年小鼠和新生小鼠的脑皮质或全脑组织,经胰蛋白酶消化分离后,分别在普通RPMI-1640培养基、含阿糖胞甙的培养基、含Neurol Medium和B_(27)的培养基3种不同条件下进行培养,观察神经元的生长情况。结果:采用普通RPMI-1640培养基培养的神经元被胶质细胞掩盖,形态不典型,神经元比例小;用含阿糖胞苷的培养基培养的神经元所含比例较高,但形态不太典型;用含Neurol Medium和B_(27)的培养基培养的神经元形态典型,生长良好。结论:采用含Neurol Medium和B_(27)的培养基可以从的乳鼠的全脑组织中培养出形态典型,生长良好,较为纯净的神经元,方法简便,得率高,这为进一步深入探讨其功能奠定了良好基础。

新生小鼠大脑皮层神经元的原代培养

目的:建立一种简便易行的体外原代培养新生小鼠大脑皮层神经元的方法。方法:采用低浓度、短时间的酶分离细胞培养法和含B-27的特殊培养基培养新生小鼠大脑皮层神经元。结果:神经元结构特征明显,生长好、得率高。结论:通过本方法可以稳定地获得较高纯度的新生小鼠大脑皮层神经元。

槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87生长并诱导其凋亡的研究

槲皮素（quercetin,Que）是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于植物界,大约68%的植物中都含有槲皮素。研究发现槲皮素具有扩张冠脉、清除自由基、抗炎、调节免疫及抗肿瘤的作用。本实验旨在研究槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87细胞增殖的作用，并探讨其可能的作用机制。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的;获得JEVE蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达。方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEVE蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEVE,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%。结论:在大肠杆菌中成功表达了JEVE蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础。

槲皮素对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心脏成纤维细胞增殖的抑制作用

目的:研究槲皮素(Quercetin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导新生大鼠心脏成纤维细胞(cardiacfibroblasts,CFb)增殖的影响,并探讨其对心肌纤维化的可能作用机制。方法:采用细胞培养技术在体外建立血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导新生大鼠心脏成纤维细胞(cardiacfibroblasts,CFb)增殖建立心肌纤维化细胞模型,采用四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖,分别观察蛋白激酶A抑制剂(H-89)、酪氨酸蛋白激酶抑制剂(genistein)及槲皮素对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响。结果:genistein抑制AngⅡ诱导心脏成纤维细胞增殖作用(P<0.01),加入Que后其抑制作用更加显著(P<0.01),但对H-89的抑制作用不明显(P>0.05),说明Que与genistein有协同作用,部分通过酪氨酸激酶途径抑制AngⅡ(10-6mol/L)诱导的细胞增殖。结论:槲皮素通过部分酪氨酸激酶途径抑制CFb增殖。

槲皮素抑制卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用研究

目的:观察槲皮素对卵巢癌细胞株生长的影响,为寻找新的卵巢癌细胞的治疗药物提供实验依据。方法:运用细胞培养、光镜观察及MTT法测定细胞活性等方法,对比卵巢癌细胞株SKOV3在加入不同浓度槲皮素作用不同时间后的生长情况和细胞活性,探讨槲皮素对卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用。结果:加入不同浓度的槲皮素后,卵巢癌细胞株SKOV3在形态学和细胞活性方面均发生改变,表现为细胞坏死、细胞生长抑制率增加,且作用浓度为50μmol/L的最为显著。结论:实验证明槲皮素有抑制卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用,具有时间依赖性,其最佳作用浓度为50μmol/L。