全葡聚糖颗粒对DC诱导CD4^+T细胞向Th17细胞分化的影响

目的研究全葡聚糖颗粒(whole glucan particle,WGP)对DC诱导CD4^+T细胞向Th17细胞分化的影响。方法采用重组小鼠FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)法诱导C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)。用MACS磁珠分选法对OT-Ⅱ小鼠的脾脏和淋巴结中CD4^+T细胞进行纯化,加入特异性抗原卵清蛋白(OVA),与DC共培养。实验分组为:CON组、WGP组、TGP-β组、WGP+TGF-β组,培养5 d后,利用流式细胞术(FCM)检测各组中CD4^+T细胞增殖和Th17细胞变化情况,ELISA检测各组细胞上清液中IL-17A的含量,Q-PCR检测各组细胞中Th17细胞核转录因子维甲酸孤儿受体-γt(retinoid-related orphan receptor-γt,ROR-γt)mRNA表达水平。结果TGF-β可以促进DC诱导CD4^+T细胞向Th17分化,而经WGP激发后,T细胞显著下调ROR-γt的转录水平,并减少对IL-17A的分泌。结论WGP显著抑制TGF-β诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化。

莱菔硫烷对小鼠肺癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:研究莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对小鼠肺癌细胞系(Lewis lung cancer cells,LLC)细胞的生长抑制作用,并探讨其作用机制。方法:CCK-8法鉴定SFN对LLC细胞增殖率的影响;流式细胞术检测SFN对LLC细胞周期和细胞凋亡的影响;DCFH-DA探针检测SFN对LLC细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达的影响;Western blot检测SFN对LLC细胞Nrf2蛋白和ERK信号通路的影响。最后通过皮下注射建立C57BL/6J小鼠肺癌模型,建模后实验组及对照组分别给予SFN及PBS灌胃处理,检测SFN治疗对小鼠肿瘤的影响。结果:细胞实验证实SFN能显著抑制小鼠LLC细胞的增殖(P<0.05),促进LLC细胞的凋亡,随着SFN浓度的增加,LLC细胞晚期凋亡比例逐渐升高(P<0.05)。细胞周期分析提示12.5μmol/L和25.0μmol/L的SFN处理可减少LLC细胞G1期比例(P<0.05),增加G2/M期的细胞比例(P<0.01),细胞周期相关基因CyclinD1、CDK4、CDK6、CyclinB1和CDK1的表达显著下降(P<0.01)。Western blot提示SFN促进LLC细胞ERK磷酸化以及增加Nrf2表达(P<0.05)。流式细胞术检测DCFH-DA探针显示SFN能显著提高LLC细胞内ROS水平。动物实验结果发现SFN处理组小鼠肿瘤显著小于对照组(P<0.05)。结论:体内及体外实验证实SFN触发LLC细胞内ERK磷酸化,使得细胞内Nrf2表达增加,细胞内ROS水平升高,阻滞细胞周期,从而加速LLC细胞的凋亡。SFN可能会是一种安全且有效的抗癌药物。

β葡聚糖抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成并促进其迁移能力

目的研究β葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞的形成和迁移能力的影响。方法培养RAW264. 7巨噬细胞,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其为泡沫细胞。油红O染色观察对照组、ox-LDL组和β葡聚糖干预组(β葡聚糖+ox-LDL孵育)泡沫细胞的形成;实时定量PCR检测各组细胞炎症因子肿瘤坏死因子α和转化生长因子β及白细胞介素6和10、CC趋化因子受体1(CCR1)、CCR2、CCR5和CCR7的mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞表面趋化因子受体的表达; TranswellTM迁移实验检测细胞对CC趋化因子配体19 (CCL19)和CCL21的趋化能力。结果 ox-LDL处理后细胞被油红O染成暗红色,而β葡聚糖干预组中细胞染色变浅;与ox-LDL组比较,β葡聚糖可下调泡沫细胞肿瘤坏死因子αmRNA的表达,并上调CCR7的表达,明显促进泡沫细胞向CCL19/CCL21的趋化反应(均为P <0. 05)。结论β葡聚糖不仅抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,还可通过促进泡沫细胞CCR7的高表达,增强其迁移能力。

检测多发性骨髓瘤患者血清TK1水平的临床意义

目的分析检测多发性骨髓瘤患者血清TK1水平对诊断、疗效监测、预后判断的意义。方法检测60例多发性骨髓瘤（MM）患者治疗前后血清TK1含量，同时检测60例缺铁性贫血（IDA）患者和30例健康人血清TK1含量作为对照。结果TK1阳性率MM组为55．0％，IDA组为8．3％，对照组为6．7％，TK1阳性率MM组明显高于IDA组和对照组，差异具有统计学意义（P〈0．01）；MM组血清TKl水平治疗前均值为3．81±2．45pmol／L，治疗后为1．88±1．72pmol／L，治疗后明显低于治疗前，差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论检测血清TKl水平对多发性骨髓瘤患者的诊断及预后分析具有重要的临床意义。

ATP生物荧光法检测乳腺癌化疗药物敏感性的应用研究

目的研究ATP生物荧光法检测乳腺癌化疗药物敏感性的应用。方法采用ATP生物荧光法，用多种化疗药物对50例乳腺癌标本化疗敏感性的异质性进行检测。结果单药中PTX标本敏感性最高，达65．9％。联合用药同样有较高的敏感性，其中ADM＋5-FU有23／43（52．3％）的标本敏感，ADM＋PTX的敏感数更高，有37／43（86％）的标本敏感。结论乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性存在个体差异，ATP生物荧光法检测的乳腺癌化疗药物敏感性可指导临床的化疗用药。

基于CRISPR-Cas9构建树突状细胞相关C型凝集素-1基因敲除小鼠模型

目的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)基因缺失小鼠模型,研究Dectin-1基因缺失对小鼠肿瘤生长的影响。方法通过CRISPR-Cas9基因编辑技术设计靶向目的基因的sgRNA实现Cas9蛋白对DNA双链的特异性切割。将体外转录纯化得到的sgRNA和ssDNA并与Cas9混合后,通过显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内并经胎盘移植到代孕小鼠体内,获得F0代小鼠。F0代小鼠通过基因鉴定和DNA测序获得Dectin-1基因缺失阳性子代小鼠。最后构建野生型与Dectin-1敲基因小鼠的肿瘤模型,经β-葡聚糖治疗后,观察两组小鼠的肿瘤生长情况。结果利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功敲除C57BL/6野生型小鼠的Dectin-1基因。PCR技术及DNA测序进一步显示Dectin-1基因部分碱基缺失,功能实验显示Dectin-1敲基因小鼠口服β-葡聚糖后肿瘤生长速度高于对照组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Dectin-1基因敲除小鼠模型,验证了Dectin-1对β-葡聚糖抗肿瘤的影响,为进一步研究Dectin-1基因在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。

三基序蛋白23在树突状细胞分化成熟中的调控作用

目的探讨三基序蛋白23(tripartite motif-containing 23, Trim23)对树突状细胞分化成熟的影响及相关作用机制。方法采用FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L)诱导小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs), 经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激发后, 荧光定量PCR及Western blot检测BMDCs中Trim23的表达。构建Trim23过表达载体并转染BMDCs, pcDNA3.1空载体作为对照组。经LPS激发后, 流式细胞术检测BMDCs表面分子CD80、CD86、CD40以及MHCⅡ的表达, ELISA检测培养上清中细胞因子IL-12p40、TNF-α、IL-6、IL-10的含量;磁珠分选出OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠脾脏和淋巴结中的CD8^(+)和CD4^(+)T细胞, 加入特异性抗原卵清蛋白(ovalbumin, OVA), 与LPS激发的BMDCs共培养。流式细胞术检测不同转染组BMDCs诱导CD8^(+)或CD4^(+)T细胞增殖分化的方向。Western blot检测BMDCs内p38、ERK1/2、AKT蛋白的磷酸化水平。构建缺失RING结构域或ARF结构域的两个Trim23短截体(Trim23 ΔRING和Trim23 ΔARF), 将Trim23、Trim23 ΔRING、Trim23 ΔARF载体分别转染BMDCs, 经LPS激发后, 流式细胞术及ELISA检测BMDCs表面分子及细胞因子的表达水平。结果经LPS激发后, BMDCs中Trim23表达水平显著下调;过表达Trim23后, 其表面分子MHCⅡ、CD86、CD80的表达及细胞因子TNF-α、IL-6的分泌均显著下降;与T细胞共培养结果显示, 过表达Trim23可显著抑制BMDCs诱导CD4^(+)T细胞增殖分化以及诱导CD8^(+)T细胞增殖的能力;Western blot结果显示, 过表达Trim23的BMDCs中p38和ERK1/2的磷酸化水平明显降低。与Trim23组比较, RING结构域的缺失显著逆转了过表达Trim23对LPS诱导的BMDCs表面分子MHCⅡ、CD86及细胞因子TNF-α、IL-6表达水平的抑制作用。结论过表达Trim23能够抑制BMDCs的分化成熟及免疫活化功能, 其作用机制可能依赖于MAPK信号通路及Trim23的RING功能域, 本研究将为靶向Trim23提高肿瘤树突状细胞疫苗的免疫应答效应提供实验参考。

β-葡聚糖联合激发型抗CD40单克隆抗体对树突状细胞免疫功能影响的体外研究

目的探讨β-葡聚糖联合激发型抗CD40单克隆抗体(5C11)对树突状细胞(DCs)的作用及分子机制。方法采用密度梯度离心法从健康人新鲜的浓缩白细胞中分离出单个核细胞,使用GM-CSF和IL-4细胞因子法诱导培养未成熟DCs,经不同刺激方式(5C11、β-葡聚糖、5C11+β-葡聚糖)激发后,流式细胞术检测不同组DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子HLA-DR的表达,ELISA法检测IL-12、IL-6、TNF-α、IL-10等相关细胞因子的表达,Western blot检测MAPK信号通路中相关蛋白质的磷酸化水平。结果β-葡聚糖能够显著诱导CD40在DCs表面的表达(P<0.05),联合5C11后,其他表面分子CD80、CD83、CD86的表达进一步显著上调,尤其对DCs成熟的重要标志分子CD83的上调表现出强烈的协同效应(P<0.01);ELISA检测结果显示β-葡聚糖联合5C11可以诱导DCs大量分泌IL-12、IL-6、TNF-α等促炎因子,对发挥DCs功能的关键因子IL-12的分泌表现出协同效应(P<0.01);Western blot结果显示p38 MAPK、p44/42 MAPK的磷酸化水平显著上升,且磷酸化时间提前,维持时间也延长(P<0.01)。结论β-葡聚糖联合5C11可协同促进DCs的成熟并提高DCs的免疫功能,为肿瘤DCs疫苗的制备方案提供了新思路。

Th1细胞在肿瘤免疫中的研究进展

辅助性T细胞(helper T cell,Th)1作为最早发现的一类CD4^+辅助性T细胞亚群,具有促进细胞免疫、增强抗肿瘤作用,它的增殖分化受肿瘤微环境和多种免疫细胞的共同调控,参与各种肿瘤免疫,越来越多的治疗方案被应用于临床,对肿瘤治疗的发展发挥重要作用。本文对近年Th1细胞在肿瘤中的研究进展做一综述。

乳腺癌细胞EGFR表达水平与长春瑞滨敏感度的相关性研究

乳腺癌是较早开始个体化治疗的肿瘤之一。表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达与乳腺癌组织学分期、生长速度呈正相关,可作为乳腺癌患者预后的指标之一。临床上,长春瑞滨(Vinorelbine,NVB)主要作为耐药性晚期乳腺癌的挽救性化疗药物,单药治疗亦具有一定疗效。该研究结果发现,乳腺癌组织EGFR表达与NVB的敏感性相关(P=0.001),而与紫杉醇、阿霉素及5-氟尿嘧啶无相关性。EGFR阴性乳腺癌细胞MDA-MB-435s对NVB耐药,而EGFR阳性细胞MCF-7则敏感,但是EGFR中和性抗体会降低敏感性。进一步研究发现,NVB会引起MCF-7表面EGFR表达上调,以及胞内ERK1/2激酶的磷酸化,且这一效应会被抗EGFR抗体部分抑制。研究结果表明,乳腺癌细胞对NVB的敏感性与膜表面EGFR表达水平相关,提示EGFR可作为NVB治疗敏感性的预测分子。