肾小管细胞来源外泌体在肾缺血再灌注损伤中的作用

肾缺血再灌注损伤是指肾组织短暂缺血后,恢复血供导致肾脏损伤程度加重的一种病理生理现象。研究发现肾小管细胞来源外泌体通过抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡、促进组织再生和激活自噬等作用减轻肾缺血再灌注损伤。本研究就肾小管细胞来源外泌体对肾缺血再灌注损伤的保护作用作一简要综述,以期为肾缺血再灌注损伤的临床诊治与早期预防提供理论依据。

血液透析患者合并糖尿病下肢动脉狭窄钙化防御1例

病例患者,女,67岁,以“血糖高7年,血液透析3年,双下肢皮肤溃疡2月”为主诉2022年3月21日入院。2015年体检发现随机指尖血糖26.5μmol/L,诊断“2型糖尿病”,予门冬胰岛素8 Iu三餐前+甘精胰岛素10 Iu睡前皮下注射,自测空腹指尖血糖10.6~16.0μmol/L。

N6-甲基腺苷修饰在糖尿病肾脏疾病中的机制研究进展

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰是指在核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的腺苷N6位点添加一个甲基,是真核RNA中最普遍、最丰富和最保守的内部共转录修饰,调控RNA的剪切、稳定性、翻译等,从而影响多种生物学过程,如肿瘤分化、代谢、免疫、干性维持等,与癌症、动脉硬化、糖尿病、心血管疾病等有关。近年来许多研究报道m6A修饰与糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)密切相关。本文通过对该领域的相关研究进行归纳总结,探索DKD中m6A相关基因及其调控机制,并总结了针对m6A修饰的药物干预措施以延缓DKD的研究进展,为早期诊断和治疗DKD探索新的靶点提供重要参考。

PI3K/AKT/NF-κB信号通路在大鼠尿酸性肾病中的作用机制

目的通过观察大鼠尿酸性肾病模型中PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达水平变化,探讨PI3K/AKT/NF-κB信号通路在尿酸致肾脏细胞损伤中的调控作用机制。方法选取36只雄性SD大鼠,随机分为实验组(n=18)和对照组(n=18)。实验组大鼠给予腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃,建立大鼠高尿酸性肾病模型;对照组给予等量生理盐水灌胃。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和核转录因子-κB(NF-κB)的基因表达水平;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测各组PI3K、AKT和NF-κB蛋白表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测下游炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-1β前体(Pro-IL-1β)和白细胞介素-1β(IL-1β)、转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平。结果实验组PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。实验组PI3K、AKT和NF-κB蛋白表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。实验组TNF-α、MCP-1、IL-6、Pro-IL-1β和IL-1β水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论高尿酸可能通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路诱导肾间质炎症和肾间质纤维化,可能参与尿酸性肾病的发生发展过程。

大鼠动静脉内瘘失功时血管内膜病理改变和血管剪切应力的相关研究

目的揭示自体动静脉内瘘失功血管内膜病理改变和血管剪切应力的变化规律。方法研究对象:选取C57BL/6小鼠,分假手术组(n=20)和手术组(n=20)。手术组应用显微外科技术建立小鼠颈动静脉内瘘模型,假手术组不建立动静脉内瘘。检测指标:①血流动力学:测定动脉压、心率、血流速度、剪切应力值;②组织病理学:HE染色观察静脉壁厚度;PAS染色观察血管壁蛋白粘多糖;Gomori银染色观察血管壁网状纤维组织;醛品红弹力纤维染色观察血管壁弹力纤维组织;CD31、CD34免疫染色观察血管壁血管内皮细胞变化。结果①血流动力学检查:与假手术组比,手术组颈动脉内径变细,血管剪切应力明显增加(t=-6.840,P<0,001)。②组织病理学检查:HE染色显示手术组静脉血管壁明显增厚,管腔狭窄;PAS染色显示手术组中性粘多糖含量明显增多;Gomori银染色显示手术组纤维增生明显;醛品红弹力纤维染色显示手术组弹力纤维增生明显,排列紊乱;CD31、CD34免疫染色显示手术组血管内皮细胞膜缺乏连续性,被纤维组织增生破坏。结论动静脉内瘘手术后血管剪切应力增加,血管内膜异常增生,伴纤维增生紊乱、炎性细胞浸润增殖,进而血管壁增厚、管腔狭窄,是导致维持性血液透析患者自体动静脉内瘘功能障碍的重要机制。

组蛋白H3K27me3介导JAK_(2)/STAT_(3)信号通路对足细胞损伤的调控机制

目的:探讨组蛋白H3K27me3介导JAK_(2)/STAT_(3)信号通路对足细胞损伤的调控机制。方法:体外培养小鼠肾足细胞MPC5,随机分为对照组及EZH_(2)-组。EZH_(2)-组小鼠肾足细胞给予EZH_(2)酶抑制剂(EPZ-6438)干预,对照组给予等量PBS培养。应用Western Blot法检测足细胞组蛋白H3K27me3、p-JAK_(2)、JAK_(2)、p-STAT_(3)、STAT_(3)蛋白水平;实时定量PCR法检测足细胞JAK_(2)、STAT_(3)mRNA水平;ChIP-chip确定组蛋白H3K27me3调控靶基因群,利用MACS2软件得出组间差异富集峰,进行基于GO、KEGG数据库的功能注释分类和通路富集分析。结果:与对照组相比,EZH_(2)-组足细胞H3K27me3蛋白表达显著下降(P<0.05),JAK_(2)/STAT_(3)信号通路相关基因及蛋白表达显著增加(P<0.05);GO富集分析发现靶基因Pigu基因呈现显著性富集,其参与JAK/STAT信号通路调控;KEGG富集分析发现靶基因参与调控信号通路主要集中在细胞溶质DNA感应途径、Rap1信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路和JAK/STAT信号通路,其中靶基因IL12rb1、IL5ra呈现显著性富集,其参与JAK/STAT信号通路调控。结论:组蛋白H3K27me3可能通过调控靶基因Pigu、IL12rb1、IL5ra参与JAK_(2)/STAT_(3)信号通路活化,导致足细胞损伤。

蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录活化因子3信号通路在局灶节段性肾小球硬化小鼠模型中的机制研究

目的通过精准化5/6肾切除术建立局灶节段性肾小球硬化(FSGS)小鼠模型,探讨蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录活化因子3(JAK2/STAT3)信号通路在FSGS小鼠模型中的发病机制。方法选取6周龄雄性C57BL/6小鼠60只,并随机分为对照组(n=30)和FSGS组(n=30)。FSGS组小鼠接受精准化5/6肾切除术,应用体积公式计算肾脏切除体积。对照组为假手术组,仅暴露双侧肾脏,剥离肾周脂肪组织后复位缝合。比较2组小鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮等指标水平;应用苏木精-伊红(HE)染色观察肾脏组织的病理学变化;应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定肾组织JAK2/STAT3信号通路的目标基因;应用Western Blot测定JAK2/STAT3信号通路的目标蛋白;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测JAK2/STAT3信号通路下游炎症因子及纤维化因子的水平。结果造模过程中,FSGS组有1只小鼠死于麻醉,予以排除;精准化5/6肾切除术建立FSGS小鼠模型的造模成功率为89.7%(26/29)。与对照组相比,FSGS组小鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮水平较高,差异有统计学意义(P<0.01)。FSGS组小鼠HE染色可见大量肾小管上皮细胞凋亡、坏死,肾小囊腔扩张,肾小球代偿性肥大及局灶性硬化,系膜细胞和系膜基质增生,伴炎细胞浸润。术后10周,FSGS组小鼠肾组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达水平,磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、JAK2、磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)、STAT3蛋白表达水平,以及白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β(TGF-β)水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论通过精准化5/6肾切除术可成功建立小鼠FSGS模型,而JAK2/STAT3信号通路活化可通过促进炎症反应、肾组织纤维化等多种途径参与FSGS的发生及发展过程。

组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)对糖尿病肾病小鼠足细胞损伤的作用

目的:选用自发性2型糖尿病db/db小鼠,探讨组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)异常修饰对糖尿病肾病小鼠足细胞损伤的机制。方法:选择db/m小鼠作为对照组(N组,n=20),选用db/db小鼠分别予PBS溶液、GSK-J_(4)尾静脉注射处理作为糖尿病肾病组(D组,n=20)、GSK-J_(4)干预组(G组,n=20)。观察:(1)一般指标:血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐水平。(2)应用免疫组织化学染色法测定小鼠肾组织H_(3)K_(27)me_(3)表达。(3)应用双重免疫荧光染色及激光共聚焦观察肾组织足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达。(4)肾脏病理学改变:应用HE染色观察肾脏组织病理变化。(5)应用TUNEL法检测足细胞凋亡程度。结果:(1)与N组相比,D组血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与D组相比,G组血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平减低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)肾组织H_(3)K_(27)me_(3)表达:与N组相比,D组肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。G组可恢复肾组织足细胞H_(3)K_(27)me_(3)表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达:与N组相比,D组肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达减少。G组可恢复肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达。(4)肾组织病理学:N组无明显异常,D组肾小球体积增大,肾小球系膜细胞增生,部分基底膜增厚,肾间质可见炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞肥大、空泡变性,管腔变窄。与D组相比,G组上述肾脏病理改变减轻。(5)足细胞凋亡程度:与N组相比,D组足细胞凋亡程度升高。G组可减轻足细胞凋亡程度。结论:糖尿病肾病发病过程中,肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达减少;给予GSK-J_(4),增加肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达,可恢复肾组织Nephrin和Podocin表达,有助于保护足细胞功能和结构完整,发挥减少尿蛋白、延缓糖尿病肾病进展的作用。

缺血预处理的肾小管细胞来源外泌体对肾缺血再灌注损伤大鼠PI3K;AKT;mTOR信号通路的调控机制

本研究拟通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)模型,观察不同外泌体处理后磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K);蛋白激酶B(protein kinase B,AKT);雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路表达变化,并进行微RNA(microRNA,miRNA)差异表达分析,揭示缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)的肾小管细胞来源外泌体在减轻大鼠RIRI中的分子机制。首先取SD大鼠10只,全麻下切除双肾,制备原代肾小管细胞。第2代肾小管细胞分别予以下处理:常氧(38%O 2、5%CO 2)、低氧(1%O 2、5%CO 2)和低氧+灭活(65℃加热30 min)培养12 h,然后提取外泌体,分别得常氧外泌体、IPC外泌体和灭活外泌体。再取SD大鼠50只,随机分为5组:假手术组(Sham组)、RIRI组、RIRI+常氧外泌体组(NC组)、RIRI+IPC外泌体组(IPC组)、RIRI+灭活外泌体组(INA组),后4组均先建立RIRI模型,NC组、IPC组和INA组RIRI建模后24 h分别尾静脉注入200μg常氧外泌体、IPC外泌体和灭活外泌体。6 d后取静脉血,摘取双肾,观察各组肾功能、肾脏组织病理及PI3K;AKT;mTOR信号通路变化,并对NC组和IPC组进行miRNA差异表达(P<0.05,|log 2FC|≥1)分析,探查miRNA表达谱变化并进行GO分析和KEGG通路富集分析。结果发现,(1)与Sham组相比,RIRI组和INA组血肌酐、尿素氮水平升高(均P<0.01);肾组织病理可见间质大量炎性细胞聚集伴不同程度水肿,肾小管结构变性肿胀,肾小管上皮细胞坏死脱落;TUNEL阳性细胞数明显升高,Ki67染色阳性细胞数明显减少;PI3K;AKT;mTOR信号通路的mRNA和蛋白表达较低。(2)与NC组相比,IPC组血肌酐和尿素氮水平较低(均P<0.01);肾间质炎性细胞聚集显著减少、组织水肿明显改善;TUNEL阳性细胞数减少,Ki67染色阳性细胞数增多;PI3K、PDK1、AKT、mTOR的mRNA和蛋白表达均较高(均P<0.05)。(3)与NC组相比,IPC组有56个miRNA表达上调,42个miRNA表达下调。GO富集分析发现,靶基因为PIK3C2A、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3C2G、AKT1、mTOR、Rheb等;KEGG富集分析发现,在PI3K;AKT信号通路和mTOR信号通路均有显著性富集。本研究揭示,在RIRI病程中,IPC肾小管细胞来源外泌体可致肾组织miRNA差异性表达,使PI3K;AKT;mTOR信号通路表达增强,在减轻大鼠RIRI中发挥重要作用。

动静脉内瘘功能障碍机制的研究进展

内瘘血管的狭窄和栓塞直接影响维持性血液透析患者的临床治疗效果,内瘘狭窄的机制成为近年来的研究热点。既往研究主要集中于血管壁的血流动力学、病理生理学,关于分子生物学及其相关的信号通路等方面的研究较少。本文将综述国内外动静脉内瘘(AVF)血管通路的血流动力学及AVF功能障碍的病理生理机制、分子生物学、多种信号通路改变的最新进展,旨在为AVF功能障碍相关研究提供参考。

尿酸诱导人肾小管上皮细胞炎症损伤中PI3K/AKT/NF-κB信号通路的调控机制

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/核因子κB(NF-κB)信号通路在人肾小管上皮细胞(human kideny-2,HK-2)-尿酸性肾病细胞模型中表达水平变化及其作用机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为对照组及实验组。实验组经高尿酸(720μmol/L)浸泡48 h建立体外尿酸性肾病细胞模型,分为高尿酸处理组、过表达蛋白激酶活化受体2(protease activated receptor 2,PAR2)组和敲减PAR2组。实时定量PCR法检测HK-2细胞PAR2、PI3K、AKT、NF-κB的mRNA表达水平,Western印迹法检测HK-2细胞PAR2、PI3K、AKT、NF-κB蛋白表达水平,酶联免疫吸附法检测上清液肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β前体(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达水平。结果(1)与对照组相比,高尿酸处理组HK-2细胞中PAR2、PI3K、AKT、NF-κB的mRNA及蛋白表达增加(均P<0.05),上清液中TNF-α、MCP-1、IL-6、pro-IL-1β、IL-1β、TGF-β1增加(均P<0.01)。(2)与高尿酸处理组相比,过表达PAR2组HK-2细胞中PAR2、PI3K、AKT、NF-κB的mRNA及蛋白表达明显增加(均P<0.05),上清液中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β、TGF-β1明显增加(均P<0.05)。(3)与高尿酸处理组相比,敲减PAR2组HK-2细胞PAR2、PI3K、AKT、NF-κB的mRNA及蛋白表达明显下降(均P<0.05),上清液中IL-6、pro-IL-1β、IL-1β、TGF-β1明显减少(均P<0.05)。结论尿酸致肾脏HK-2细胞损伤过程中,尿酸通过激活PAR2显著上调PI3K/AKT/NF-κB信号通路表达,导致HK-2细胞炎症损伤明显加重。敲减PAR2抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路,可有效减轻HK-2细胞炎症损伤。

肾移植急性排斥大鼠的CD4^+CD25^+调节性T细胞水平及相关调节因子的表达变化

目的观察肾移植术后急性排斥大鼠外周血中叉头状转录因子3(Foxp3)阳性的CD4^+CD25^+调节性T细胞(CD4^+CD25^+ Treg细胞)水平及其T盒转录因子TBX1(TBX1)和肌细胞特异性增强因子2D(MEF2D)表达变化,结合肾功能、血浆白细胞介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)及肾组织病理变化,探讨其中的调控机制。方法建立大鼠肾移植模型,分为急性排斥组(急排组)和非急性排斥(非急排)组。测定两组大鼠肾功能(尿素氮和血肌酐);ELISA法测定血浆中IL-10和IFN-γ;HE染色法观察肾脏组织病理。应用流式细胞术分选测定CD4^+CD25^+ Treg细胞;实时定量PCR测定CD4^+CD25^+ Treg细胞的Foxp3、TBX1和MEF2D mRNA表达;Western印迹测定CD4^+CD25^+ Treg细胞Foxp3、TBX1和MEF2D蛋白表达。结果与非急排组相比,急排组尿素氮和血肌酐均升高,IL-10下降,IFN-γ升高(均P<0.05)。急排组肾组织病理出现肾小球肥大和系膜细胞显著增生,毛细血管增生和中性粒细胞浸润;肾间质明显水肿和肾小管坏死,伴有淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞浸润。与非急排组相比,急排组外周血CD4^+CD25^+ Treg细胞比例降低(4.50%±0.50%比5.74%±1.96%,P<0.05),CD4^+CD25^+ Treg细胞Foxp3、MEF2D的mRNA和蛋白表达均降低(均P<0.01),TBX1的mRNA和蛋白表达均升高(均P<0.01)。结论肾移植急性排斥大鼠免疫耐受细胞CD4^+CD25^+ Treg细胞减少,Foxp3、MEF2D、IL-10表达降低,TBX1、IFN-γ表达增强,共同促进肾移植急性排斥反应的发生发展,加重肾损伤。

JAK_(2)/STAT_(3)信号通路在局灶节段性肾小球硬化足细胞损伤中的作用及机制

目的建立阿霉素诱导的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)小鼠模型,探讨JAK_(2)/STAT_(3)信号通路在FSGS足细胞损伤中的作用及机制。方法选用8周龄雄性C57BL/6小鼠建立阿霉素诱导的FSGS小鼠模型,随机分为FSGS组和对照组,每组各20只。FSGS组予以25 mg/kg单次尾静脉注射阿霉素,对照组予同等剂量的PBS溶液。观察24 h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐等一般指标。HE染色观察肾组织病理;透射电镜观察肾小球基底膜厚度、足细胞形态;双重免疫荧光染色及激光共聚焦观察足细胞nephrin和podocin表达;TUNEL法检测足细胞凋亡。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测2组肾组织Janus激酶2(JAK2)、信号转导和转录活化因子3(STAT3)mRNA水平;Western印迹法检测肾组织JAK_(2)、STAT_(3)蛋白水平;酶联免疫吸附法检测肾组织白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))水平。结果(1)与对照组相比,FSGS组24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮均升高,差异均有统计学意义(P均<0.01)。(2)与对照组相比,光镜下,FSGS组小鼠系膜区基质增生,肾小管上皮细胞凋亡、坏死,节段中度加重,毛细血管结构受压狭窄,足细胞增生明显;电镜下FSGS组肾小球基底膜增厚,足细胞融合;激光共聚焦观察显示,FSGS组足细胞nephrin和podocin表达减少;光镜下FSGS组足细胞凋亡增多。(3)与对照组相比,FSGS组肾组织JAK_(2)、STAT_(3) mRNA及蛋白水平增加(P均<0.01),肾组织IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β_(1)水平升高(P均<0.01),差异有统计学意义。结论阿霉素建立FSGS小鼠模型稳定可靠,JAK_(2)/STAT_(3)信号通路可通过促进下游因子活化、氧化应激、细胞凋亡等途径参与FSGS足细胞损伤的发生发展。

缺血预处理肾小管细胞来源外泌体修复大鼠肾缺血再灌注损伤的作用机制

目的精细化手术方式夹闭双侧肾动脉建立大鼠肾缺血再灌注损伤(RIRI)模型,探讨缺血预处理(IPC)肾小管细胞来源外泌体对RIRI的保护作用机制。方法选取25只雌性SD大鼠,分成5组(n=5):假手术组、模型组、灭活组、常氧组、IPC组。假手术组仅游离双侧肾动脉即消毒关闭背部切口。模型组建立RIRI模型;灭活组、常氧组、IPC组建立RIRI模型后24 h尾静脉分别注入200μg的灭活外泌体、正常外泌体、IPC外泌体。检测各组大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,光镜观察肾组织病理变化,透射电子显微镜(TEM)观察肾小管细胞外泌体形态和大小,纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测肾小管细胞外泌体浓度和粒径。结果模型组血清Scr、BUN水平明显高于假手术组(均P<0.01),肾组织病理见大量炎症细胞聚集伴不同程度的水肿,肾小管损伤明显,上皮细胞坏死脱落。常氧组、IPC组血清Scr、BUN水平低于灭活组(均P<0.01),肾组织病理见肾小管细胞脱落坏死减轻,炎症细胞减少,细胞水肿改善。IPC组大鼠血清Scr、BUN水平明显低于常氧组(均P<0.01),肾组织病理见炎症细胞、细胞坏死明显减少,细胞水肿显著改善。结论精细化手术方式夹闭双侧肾动脉是建立RIRI大鼠模型的较优方式。IPC肾小管细胞来源外泌体对RIRI具有保护修复作用。

HO-1/CO/PPAR-γ信号通路在小鼠动静脉内瘘内膜增生过程中的变化

目的观察HO-1/CO/PPAR-γ信号通路在小鼠动静脉内瘘内膜增生病理损害中的变化规律。方法选取雄性野生型小鼠随机分为模型组及对照组,每组18只。应用显微外科技术建立小鼠颈动静脉内瘘模型(模型组),对照组仅做手术切口缝合。术后21天使用过量戊巴比妥钠处死小鼠,获取血液及病理标本。应用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂蛋白α、总胆红素水平;HE染色检测血管壁变化;应用分子染色方法对标记的活性氧(reactive oxygen species,ROS)进行检测;应用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测定目标基因血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)、过氧化物酶增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPAR-γ)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的mRNA水平;应用Western blot法测定目标基因HO-1、PPAR-γ及MMP-9的蛋白表达;应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定HO-1/CO/PPAR-γ信号通路下游因子转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-8表达水平。结果模型组小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和总胆红素较对照组明显降低,差异具有统计学意义[mmol/L:(3.45±0.32)比(4.03±0.16),(1.62±0.42)比(2.06±0.35),(3.87±0.30)比(5.11±0.26),(0.45±0.04)比(0.65±0.09),(11.28±1.73)比(13.47±0.87),t值分别为-6.88、-3.41、-13.25、-8.62和-4.80,P值均<0.05]。HE染色提示,模型组小鼠静脉壁内膜厚度较对照组明显增厚,血管壁中活性氧ROS水平较对照组明显升高,差异具有统计学意义[EU/mg:(99.11±6.34)比(89.71±8.41),t=3.79,P<0.05]。与对照组相比,模型组小鼠HO-1/CO/PPAR-γ信号通路目标基因及蛋白HO-1、PPAR-γ、MMP-9 mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义[目标基因:(1.02±0.69)比(7.17±2.16),(0.96±0.04)比(6.75±0.24),(0.61±0.35)比(1.02±0.03),t值分别为11.51、100.96和4.95,P值均<0.05;目标蛋白:(0.07±0.02)比(0.41±0.01),(0.27±0.04)比(0.35±0.05),(0.12±0.02)比(0.45±0.08),t值分别为81.43、5.19和17.39,P值均<0.05]。与对照组相比,模型组小鼠HO-1/CO/PPAR-γ信号通路下游炎性因子TGF-β、IL-1β、IL-8分泌明显升高,差异有统计学意义[pg/mL:(3.52±2.92)比(27.46±2.70),(16.78±0.60)比(38.54±2.53),(35.20±1.95)比(101.71±7.75),t值分别为25.53、35.55和35.31,P值均<0.05]。结论HO-1/CO/PPAR信号通路参与了小鼠动静脉内瘘血管内膜增生发生发展过程,并通过提高目标基因、目标蛋白的表达水平,增强相关炎性因子的释放等途径保护内膜功能,减轻血管的损伤。

小鼠动静脉内瘘增生狭窄的差异基因测序比对分析

目的构建小鼠颈内动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)模型,筛选AVF内膜增生狭窄过程中的差异表达基因,分析研究参与AVF内膜增生狭窄的异常表达信号通路及作用机制。方法选取雄性C57BL/6小鼠46只,按简单随机法分为AVF组和假手术组,每组23只。AVF组行小鼠颈内AVF成形术,假手术组分离右侧颈外静脉、颈总动脉后缝合切口。应用转录组学可逆链终止物和合成测序法测定AVF内膜增生狭窄小鼠全基因组序列,建立微阵列数据集;应用基因芯片数据分析多重假设检验校正(Benjamini&Hochberg法)筛选AVF增生狭窄过程中的差异表达基因;利用R语言富集分析筛选AVF内膜增生狭窄过程中的差异表达基因,并对差异表达基因及信号通路进行基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析;应用多样性增量分析BUSCA软件进行AVF增生狭窄差异表达基因亚细胞定位;应用STRING数据库及Cytoscape软件进行差异表达基因的蛋白网络互作可视化分析。结果AVF组造模成功21只,失败2只,故最终AVF组21只,假手术组亦仅执行手术操作21只。小鼠颈内AVF模型创新采用连续⁃间断缝合法,提高了此模型建模的成功率。差异基因测序比对分析显示,AVF增生狭窄过程中差异表达基因2514个,其中上调基因1323个,下调基因1191个;GO功能富集分析显示,差异基因主要富集在代谢过程、活性激活、氧化还原及线粒体等;KEGG通路富集分析显示,差异富集在代谢、能量物质合成、糖尿病、氧化应激等相关信号通路;亚细胞定位统计分析显示,差异蛋白主要在线粒体蛋白(24.24%)、胞质蛋白(17.51%)、细胞核蛋白(13.13%)、细胞膜蛋白(11.45%)、细胞外蛋白(10.77%)。结论线粒体氧化应激损伤可能参与AVF内膜增生狭窄的病理损害过程。