遗传性牙龈纤维瘤病的临床特点及致病基因检测

目的检测分析遗传性牙龈纤维瘤病(hereditary gingival fibromatosis,HGF)患者的临床特点及致病基因。方法收集HGF家系1个,采用先证者查证法对其家庭成员进行全身健康状况及口腔专科检查。收集患者及健康牙龈组织作HE和Masson染色进行组织学检查。抽取患者及正常家族成员的静脉血,提取基因组DNA,PCR扩增SOS1基因并测序,同源性比较分析(basic local alignment search tool,BLAST)。结果患者牙龈组织HE染色显示典型牙龈纤维瘤病的组织病理表现,Masson染色显示胶原纤维较正常人丰富。SOS1基因突变检测未发现突变点。结论 HGF具有高度遗传异质性,目前被成功克隆与鉴定的致病基因SOS1不是唯一的致病基因。

人牙周膜细胞群多向分化潜能的实验研究

目的研究体外培养的人牙周膜细胞群（hPDLP）向成骨和成脂方向分化的潜能,为牙周组织工程提供可靠的种子细胞来源。方法组织块法分离培养人牙周膜细胞群,流式细胞术检测间充质干细胞标记CD146和STRO-1的表达;利用茜素红、油红O染色、免疫组化以及反转录聚合酶链反应（RT-PCR）等检测hPDLP的多向分化标志。结果第1代hPDLP的CD146和STRO-1阳性率分别是27.20%±3.98%和4.23%±4.08%;经矿化诱导可以形成矿化结节,有钙盐沉积;经成脂诱导可见特异性脂滴形成,特异性转录因子过氧化物酶体激活物增生受体2（PPARγ2）和脂蛋白脂酶（LPL）表达上调。第8代hPDLP相对第1代的矿化能力没有差异,但成脂方向分化潜能减弱。结论体外培养的hPDLP具有向成骨和成脂样细胞分化潜能,第1~3代细胞群明显具有牙周膜干细胞的多向分化潜能优势。

肥胖复合牙周炎大鼠血清及牙龈中TNF-α、IL-1β水平与胰岛素抵抗的关系

目的:观察牙周炎复合肥胖大鼠血清及牙龈组织中炎症因子的水平与胰岛素抵抗的关系。方法:取SPF级新生SD大鼠32只,随机分为正常对照组(C)、肥胖组(OB)、牙周炎组(CP)、牙周炎复合肥胖组(OB+CP)(n=8),通过皮下注射谷氨酸钠建立肥胖模型;丝线结扎联合局部接种牙周致病菌(Pg、Ha、Pi、Fn)建立牙周炎模型。采用ELISA法和免疫组化染色法分别检测大鼠血清及牙龈组织中的TNF-α、IL-1β含量,并与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)行相关性分析。结果:与正常对照组相比,各组血清中的TNF-α和IL-1β水平均明显升高(P<0.05),其中以OB+CP组升高幅度最大(P<0.05);HOMA-IR评分也以OB+CP组最高,肥胖大鼠血清中TNF-α及IL-1β水平与HOMA-IR均呈正相关(rTNF-α=0.854,rIL-1β=0.730)。各组牙龈组织中的TNF-α及IL-1β水平以CP组最高(P<0.05),其次为OB+CP组,其TNF-α及IL-1β水平低于CP组(P<0.05),但均高于C组和OB组(P<0.05);OB组牙龈组织中的TNF-α、IL-1β水平与正常对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:牙周炎可能通过促进血清中炎症因子的分泌而加剧肥胖机体的胰岛素抵抗。

颅骨锁骨发育不良患者牙齿矿化不全超微结构的研究

目的:研究成骨细胞特异性转录因子(runt-related gene2,runx2)基因突变导致的颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia,CCD)患牙超微结构以及Ca、P元素含量的改变。方法:收集临床CCD患者的滞留乳牙以及萌出下恒切牙,制备牙齿磨片,通过扫描电镜研究CCD患牙超微结构的改变,通过色散能分光计对牙釉质和牙本质中Ca、P元素含量进行能谱分析。结果:与正常牙齿相比,CCD患牙发育不良:釉丛和釉板结构增多,釉牙本质界平直,牙本质小管分布不均,牙骨质薄;牙釉质和牙本质中Ca、P含量降低。结论:runx2基因突变对CCD患者牙齿构成及其组成元素均有很大的影响,表明runx2基因对于牙齿正常发育有重要作用。

维生素D受体TaqⅠ位点单核苷酸多态性与重度慢性牙周炎易感性的相关性

目的探讨维生素D受体(VDR)基因TaqⅠ位点单核苷酸多态性(SNP)与汉族人群重度慢性牙周炎(CP)易感性的相关关系。方法收集汉族重度慢性牙周炎患者(观察组)156例及150例牙周健康对照者的颊黏膜拭子,以Chelex-100法提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定TaqⅠ基因型,并分析组间基因型和等位基因频率的差异。结果观察组和对照组基因型及等位基因频率分布差异均有统计学意义(P分别为0.0097和0.016),TTvs(Tt+tt)OR=2.63,95%CI为1.28～5.42,TvstOR=2.27,95%CI为1.15～4.50。结论VDR基因TaqⅠ位点单核苷酸多态性与汉族人群重度慢性牙周炎易感性可能存在一定的联系。

纳米Ag/TiO_2涂层托槽对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性能

目的研究纳米Ag/TiO2涂层托槽对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性能,初步分析探讨托槽的抗菌机制。方法采用贴膜法计算纳米Ag/TiO2涂层对牙龈卟啉单胞菌的抗菌率,检测不同作用时间下纳米Ag/TiO2涂层对牙龈素活性的影响。结果纳米Ag/TiO2涂层对牙龈卟啉单胞菌在20 min黑暗环境下抗菌率达88.47%,具有良好的抗菌效果;在黑暗环境下能同时降解牙龈卟啉单胞菌胞内外的牙龈素,显著抑制其活性。结论纳米Ag/TiO2涂层托槽对口腔内牙龈卟啉单胞菌有较强的抗菌效果,可抑制其重要毒力因子牙龈素活性。

颅骨锁骨发育不良综合征患者的RUNX2基因突变检测分析

目的:检测鉴定我国一个颅骨锁骨发育不良综合征(CCD)家系RUNX2基因突变情况。方法:采用先证者查证法,对家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查,进行CCD诊断;抽取先证者及其父母外周静脉血,提取基因组DNA,PCR扩增RUNX2基因并测序,BLAST同源分析,同时检测100名健康人的相同位点,排除多态位点的可能。结果:先证者具有典型的CCD临床特征,其母亲亦为CCD患者,父亲则无相应临床表现;将先证者的RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析,在Exon2上发现了一个A→G突变;实际测序图谱显示双峰结构(G、A),对其CCD母亲的基因检测表明,此突变来自母系染色体该基因478位点的基因突变;密码子AAC→GAC可能部分引起第160位氨基酸的改变,天冬酰胺(Asn,N)变成天冬氨酸(Asp,D);该突变型为478A>G,N160D。家系健康成员同一位点显示G的单峰,即与野生型序列相同。结论:检测到的478A>G,N160D为新的基因突变位点,拓展了国内CCD基因层次的研究领域,为国内外CCD致病基因的突变位点数据库增添了新的资料。

Emdogain诱导人牙周膜细胞群向成牙骨质细胞分化的研究

目的探讨人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell populations,hPDLPs)在Emdogain(EMD,商品化的猪釉基质蛋白)诱导下生物学特性的改变。方法组织块法分离培养牙周膜细胞,用含100 mg/L EMD的培养液诱导6 d,光镜下观察细胞形态改变,扫描电镜观察细胞在牙骨质片上的形态变化。免疫细胞化学检测成牙骨质细胞相关矿化蛋白:骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COLⅠ)的表达。结果EMD诱导后细胞由长梭形向多角形的类成牙骨质细胞分化。免疫组织化学检测结果显示诱导后BSP、COLⅠ的表达增强。结论EMD可以诱导人牙周膜细胞群向类成牙骨质细胞方向分化。

人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96%(24/25),细胞生长状态良好;应用酶解组织块法成功率80%(16/20);应用酶消化法成功率75%(12/16)。结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高。

聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳和琼脂糖水平电泳检测基因型的比较研究

目的比较聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)垂直板法-银染和琼脂糖凝胶水平电泳应用于环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)-1195GA基因型检测的效果。方法由两名实验人员分别应用PAGE垂直板法-银染和琼脂糖水平电泳两种方法读取100例患者的COX-2-1195GA基因型,比较结果一致性以及两种方法的特点。结果两种方法检测结果符合率100%。PAGE垂直板法-银染灵敏度较高,但技术难度较大,操作时间长,成本高,图片较难编辑;琼脂糖凝胶水平电泳可分离相差50 bp的片段,且操作简单,节省时间,图片易编辑。结论在酶切片段易于分离检测时,琼脂糖凝胶水平电泳可推广应用于聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析的基因型检测。

体外培养人牙囊细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙囊细胞的生物学特性。方法分离18岁人埋伏阻生下颌第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,取不同代数细胞行HE染色观察细胞形态,MTS四唑盐比色法检测细胞增殖活性,茜素红染色定量分析成骨能力。结果第9代细胞面积比第3代、第6代细胞面积显著增大(P<0.05);第3、6、9代细胞增殖活性两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);第3代细胞成骨能力明显强于第6代细胞(P<0.05)。结论随着体外培养代数的增加,人牙囊细胞生物学特征发生明显变化,面积逐渐增大,增殖活性逐渐变缓,成骨分化潜力逐渐减弱。

白细胞介素-4基因-590C/T多态性与慢性牙周炎的相关性研究

目的研究白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)基因-590C/T多态性与慢性牙周炎易感性的关系。方法采用病例对照试验设计,聚合酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性基因分析方法,比较104例慢性牙周炎患者(慢性牙周炎组)和106例牙周健康者(健康对照组)IL-4基因-590位点基因型和等位基因分布特点。结果 IL-4基因-590位点C、T等位基因频率(2χ=0.771,P=0.380)及基因型频率(2χ=1.904,P=0.386)在两组间分布差异无统计学意义。结论 IL-4基因-590位点的多态性与汉族人群慢性牙周炎的易感性无明显相关性。

高糖状态对脂多糖诱导人牙龈上皮细胞表达炎症因子的影响

目的研究高糖状态对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGECs)表达炎症因子的影响。方法原代培养HGECs,取第3代细胞分别在含5.5 mmol/L D-葡萄糖(对照组)、含25 mmol/L D-葡萄糖(高糖组)培养基中培养48 h后,加入0μg/m L、1μg/m L、5μg/m L和10μg/m L的LPS,2 h、4 h和8 h时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-1β(interleukin-1,IL-1β)的mRNA表达,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-8的表达。结果在5μg/m L LPS刺激8 h后,高糖组和对照组HGECs炎症因子转录水平IL-6分别为13.20±0.84和8.85±0.53(t=7.60,P=0.002),IL-8分别为14.88±1.54和8.12±0.46(t=7.281,P=0.002),IL-1β分别为1.69±0.19和1.27±0.11(t=3.348,P=0.029),两组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);两组细胞培养上清液中IL-8的表达分别为(134.0±10.8)pg/m L和(103.0±11.0)pg/m L,差异具有统计学意义(t=3.480,P=0.025)。结论高糖状态可增强LPS诱导HGECs炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β的表达。

两种清洗方法对根管锉清洗效果的比较

目的评价超声清洗法和热清洗法清洗根管锉的效果。方法分别用超声清洗法和热清洗法对污染的不锈钢根管锉和镍钛根管锉进行清洗,清洗后各组根管锉进行微生物学检测,比较两种清洗方法的清洁效果及对灭菌效果的影响。结果超声清洗法细菌清除率达99.88%,而热清洗法细菌清除率达到99.98%,两种清洗方法清除细菌的效果差异无统计学意义,根管锉的大小、类型对清洗效果无影响。无论用什么方法清洗,压力蒸汽灭菌后根管锉表面均无细菌检出。结论超声清洗法与热清洗法均能清除根管锉表面大部分细菌;无论根管锉表面是否存在生物碎屑,压力蒸汽灭菌法都能达到有效灭菌效果。

RUNX2突变牙髓细胞转化生长因子-β相关信号通路基因表达的分析

目的利用第二代功能分类基因芯片检测颅骨锁骨发育不良患者成骨细胞特异性转录因子(runt-related gene 2,RUNX2)基因突变的牙髓细胞在转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)-骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号传导通路上的基因表达差异。方法利用本课题组前期成功分离培养的携带RUNX2致病基因突变的牙髓细胞,通过第二代TGF-β/BMP信号传导通路功能分类基因芯片,进行实时定量PCR基因芯片,检测携带突变的颅骨锁骨发育不良患者牙髓细胞与正常牙髓细胞的基因表达差异,进行数据分析。结果基因芯片的实时定量PCR结果分析表明,在TGF-β/BMP信号传导通路上,RUNX2基因突变的牙髓细胞有18条基因表达上调,14条基因表达下调。结论 RUNX2基因可能通过调节TGF-β/BMP信号传导通路相关基因表达而影响牙髓细胞生物学特性。

携带RUNX2基因突变的人牙囊细胞的分离培养及鉴定

目的:研究携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞的分离、鉴定及意义。方法:收集颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia,CCD)患者,鉴定其致病基因RUNX2的突变位点,通过离体培养CCD患者的未萌牙牙囊细胞,检测其携带的基因突变位点,鉴定RUNX2+/m牙囊细胞。结果:全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,该突变型为c.309_310insTG,成功分离培养及鉴定RUNX2+/m牙囊细胞,并发现RUNX2基因突变减少了牙囊细胞中此蛋白的表达水平。结论:成功分离培养携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞,为进一步研究RUNX2基因在牙囊及牙齿萌出中的作用提供实验模型。

IL-10-1082 G/A基因位点单核苷酸多态性与汉族人群重度慢性牙周炎发病风险的病例对照研究

目的探讨白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)基因1082G/A位点单核苷酸多态性与汉族人群重度慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)发病风险的关系。方法收集汉族重度慢性牙周炎患者146例及牙周健康对照者138人的颊黏膜拭子,以Chelex-100法提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(poly-merase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分析法测定IL-10-1082G/A基因型,并分析组间基因型和等位基因频率的差异。结果CP组和对照组AA基因型分布分别率为91.8%和89.1%,P=0.45;A等位基因频率分别为95.9%和94.6%,P=0.46,差异无统计学意义。结论IL-10-1082G/A位点单核苷酸多态性与汉族人群重度慢性牙周炎发病风险无相关关系。

Th1/Th17细胞相关因子在根管治疗后疾病患牙根尖组织中的表达

目的研究Th1/Th17细胞相关因子在根管治疗后疾病(post-treatment endodontic disease,PED)患牙根尖组织中的表达。方法收集12例根管治疗失败患牙的根尖组织样本,制作组织学切片后,以免疫组化方法检测根尖组织样本中Th1/Th17细胞相关因子白细胞介素-17、干扰素-γ蛋白的表达,用Image Pro Plus图像分析软件测量各样本中阳性染色区域的平均光密度值,并进行统计学分析。结果 12例样本病理检查确诊2例根尖肉芽肿,10例根尖囊肿,通过免疫组化检验证实12例病变组织均检测出白细胞介素-17、干扰素-γ蛋白的表达,且白细胞介素-17表达高于干扰素-γ(t=6.720,P<0.05)。结论 Th1/Th17细胞相关因子均参与了根管治疗失败患牙根尖炎症过程,而Th17型炎症反应可能在PED发生中发挥主要作用。

牙周局部炎症影响小鼠肠道机械及免疫屏障功能

目的探索牙周局部炎症对小鼠肠道屏障(生态屏障、机械屏障、免疫屏障)功能的影响。方法将20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为牙周炎组(P组)和对照组(C组),每组10只。P组使用浸泡牙龈卟啉单胞菌的丝线行牙周结扎10 d,C组假性结扎。分离上颌骨测量牙槽骨丧失量,取肠道内容物行16s r RNA焦磷酸测序分析菌群结构,免疫组织化学检测回肠组织occludin、claudin2、NOD2蛋白的表达。结果 P组的牙槽骨丧失量高于C组(P<0.001)。P组与C组的主要菌门及卟啉单胞菌种比例无统计学差异(P>0.05),P组occludin、claudin2、NOD2的表达高于C组(P=0.039,P=0.011,P=0.039)。结论牙周局部炎症在一定程度上影响了小鼠肠道的机械及免疫屏障功能。

腭裂相关基因mcpr1在小鼠腭突发育及腭裂发生中的表达研究

目的检测mcpr1基因的蛋白在正常腭突及小鼠腭裂模型腭突发育中的时空表达模式。方法实验组管饲含全反式维甲酸的植物油诱导建立小鼠腭裂模型,对照组小鼠管饲植物油。2组取胎龄12、13、14、16 d的胎鼠各3只,包埋切片,HE染色观察2组胎鼠腭部发育的形态学变化,免疫组织化学方法观察MCPR1蛋白在2组胎鼠腭突中的表达差异。结果成功建立小鼠腭裂模型。切片HE染色观察发现实验组双侧腭突体积较对照组小,两侧腭突未接触;而对照组腭突融合,腭骨形成。免疫组织化学检查结果表明对照组小鼠胎龄12 d时MCPR1蛋白在腭突上皮细胞呈强阳性表达;而实验组小鼠胎龄12 d时腭突间充质细胞内MCPR1蛋白的表达较强,实验组胎龄16 d小鼠仅在上皮细胞附近的间充质细胞中有阳性表达。同一时间点比较,MCPR1蛋白的表达在实验组均强于对照组(P<0.05)。结论 MCPR1蛋白的表达变化随腭部发育存在时空表达差异。