一株高效溶解钾长石芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

从风化的钾质粗面岩表面分离筛选到1株高效风化钾长石的芽孢杆菌E31菌株,通过菌株的生理生化特征并结合菌株16S r DNA序列分析,E31菌株被鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。同时对E31菌株溶解钾长石的效应与机制以及生物学特性进行了研究。结果表明,E31菌株能风化钾长石并释放出其中的元素,28℃振荡培养不同时间,接菌处理发酵液中可溶性K、Fe、Ca、Al含量分别比对照提高了19.6%~25.6%、1~12.5倍、10.4%~47.2%和1.2~4.5倍。在钾长石存在条件下接菌处理发酵液pH为3.62~3.80,发酵液中葡萄糖酸含量达61~1 794 mg/L,发酵液细胞数量达(8.7~16.1)×10~6 cfu/ml,表明菌株可以通过代谢产生的有机酸来加速对钾长石的分解作用。另外,E31菌株能够合成生长素和铁载体,E31菌株对温度、pH和盐浓度具有较强的耐受性。

一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术

背景与目的 :建立一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术。材料与方法 :取术后部分卵巢组织 ,穿刺卵泡获得未成熟卵母细胞 ,在含激素的培养基中培养24～36h。结果 :经培养的人卵母细胞合符成熟的判断标准 :①含有第一极体 ;②胞浆匀称 ,色浅 ,颗粒均匀。结论 :该方法稳定 。

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化可能性,为心肌细胞移植探索新细胞来源。方法采用5-氮杂胞苷(5-Aza)和二甲基亚砜(DMSO)诱导人脐带间充质干细胞分化。观察诱导后分化细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化心肌样细胞的心肌肌钙蛋白I(troponin I)、心肌肌钙蛋白T(troponin T)和心肌结蛋白(desmin),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定分化的心肌样细胞是否有细胞心肌特异转录因子(Nkx2.5)和心肌细胞desmin的cDNA表达。结果人脐带MSCs经5-Aza和DMSO诱导后可向心肌样细胞分化,分化细胞表达心肌细胞的标记troponinI、troponinT和desmin。RT-PCR检测证实,人脐带MSCs诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经5-Aza和DMSO诱导后表达心肌细胞标记Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,5-Aza和DMSO可作为心肌细胞诱导剂,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞的来源。

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。

精浆ROS、PON-1、MDA联合精子DNA碎片指数在男性不育症患者中的研究

目的研究分析男性不育症患者的精浆氧自由基(ROS)、对氧磷酶-1(PON-1)、丙二醛(MDA)和精子DNA碎片指数(DFI)水平,以期为男性不育症的诊断及治疗提供一些临床依据。方法选择2017年6月至2018年6月在惠州市中心人民医院就诊的50例男性不育症患者作为试验组,另选择该院二胎孕前检查者50例作为对照组,采集患者精液并完成精液常规、精浆ROS、PON-1、MDA和精子DFI及ROS、PON-1、MDA检查,同时分析精子DFI及ROS、PON-1、MDA与DFI的相关性。结果与对照组比较,试验组患者精子浓度、精子存活率及前向运动精子率均明显降低,精浆ROS、MDA和精子DFI显著升高,精浆PON-1水平明显降低,精浆ROS、MDA水平与精子DFI之间呈正相关(r=0.538、0.737),精浆PON-1与精子DFI之间呈负相关(r=-0.371),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论精浆ROS、PON-1、MDA水平和精子DFI的检测可为男性不育症的诊断和治疗提供依据,具有一定的临床应用价值。

卵母细胞携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达

背景与目的:研究卵母细胞携带的乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)DNA能否在小鼠早期胚胎中复制与表达,为HBV经卵垂直传播提供科学证据。材料与方法:手术暴露昆明小鼠卵巢,将pBR322_HBV重组质粒DNA注射到昆明小鼠卵巢内,1个动情周期(4d)后进行超排卵并与正常雄性小鼠合笼,收集二细胞胚,用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)检测HBV在早期胚胎内的整合和复制;用逆转录聚含酶链反应(Reversetranscriptase_polymerasechainreaction,RT_PCR)和免疫荧光试验检测HBV基因在早期胚胎的表达。结果:FISH在小鼠二细胞胚细胞核上检测到HBVDNA阳性杂交信号,RT_PCR和免疫荧光试验在二细胞胚内检测到HBxmRNA和HBsAg。结论:HBVDNA进入雌性生殖细胞后,可以整合到宿主基因组内,通过自然受精随卵母细胞进入胚胎,并能在胚胎中复制与表达。提示HBV有可能通过雌性生殖细胞进行垂直传递。

HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究。 材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体。用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞。结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带。Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号。用每次实验的最后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性。荧光原位杂交在1000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号。结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上。此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎。

精子携带的乙肝病毒基因在金黄地鼠胚胎中的复制与表达

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。本研究旨在探索乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)通过精子垂直传播的可能性。方法:将金黄地鼠精子与pBR322-HBVDNA重组质粒进行共培养后,与金黄地鼠正常卵母细胞受精,取2-细胞胚分别制片和提取RNA,用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)、RT-PCR和免疫荧光检测技术研究精子携带的HBV基因在胚胎细胞中的复制与表达。结果:①FISH:用全长HBVDNA探针与128个2-细胞胚进行FISH,其中3个胚胎FISH结果阳性,每个胚胎的2个间期核上均有HBVDNA杂交信号;②RT-PCR:在检测样本中可见特异的HBxDNA阳性条带,阴性对照1(模板为灭菌水)和阴性对照2(未加反转录酶)均为阴性;③免疫荧光检测:2-细胞胚经血清封闭后,分成两组。一组作检测样本,另一组用PBS代替一抗(小鼠抗人HBsAg)作为阴性对照,检测样本中可见阳性免疫荧光信号,阴性对照未见信号。结论:以精子为载体,携带到卵内的HBV基因能够在胚胎细胞中复制和表达,提示HBV能够通过男性生殖细胞由父亲垂直传递给子代。

精子携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达

背景与目的:研究乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)DNA在早期胚胎中能否复制与表达,探讨HBV经雄性生殖细胞垂直传递的可能性。材料与方法:成熟雄鼠麻醉后双侧睾丸注射经脂质体DOSPER包裹的HBV质粒,手术后雄鼠与超排雌鼠合笼交配,用荧光原位杂变(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)分别检测单细胞胚和二细胞胚间期核中HBVDNA的存在与复制,用逆转录聚含酶链反应(Reversetranscriptase_polymerasechainreaction,RT_PCR)和免疫荧光方法检测HBV基因在二细胞胚胎中的表达。结果:在单细胞胚和二细胞胚间期核内发现HBVDNA阳性杂交信号,RT_PCR可以扩增出HBx基因的特异条带,免疫荧光也可见到HBsAg阳性信号。结论:HBVDNA进入雄性生殖细胞后,可以整合到宿主基因组内,通过自然受精随精子进入卵母细胞,并在早期胚胎中复制与表达。提示HBV有可能通过雄性生殖细胞进行垂直传递。

精子为载体的基因转移研究

采用共培养和脂质体介导两种方法将金黄地鼠附睾内的精子与 NFκB luc+ 质粒共孵育后,再与成熟的卵母细胞进行体外受精,用PCR、Southern blot及荧光原位杂交(FISH)等技术检测外源基因在精子细胞和在受精卵中的存在及存在部位,并对相关数据进行统计学比较分析。结果表明,金黄地鼠附睾内的活精子具有主动捕获外源基因的能力,而且外源基因只存在于精子细胞的头部,而且通过受精将外源基因带入了卵细胞,脂质体的存在增加了外源基因转染精子的效率和转基因效率。

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能。方法采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养。用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况。结果以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Western blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f。结论用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能。

9.4T MRS观察人脐带间充质干细胞代谢特征

目的利用9.4T高分辨力MRS检测人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的水溶性及脂溶性提取物,明确其频谱代谢特征。方法培养获取hUCMSCs,利用甲醇/氯仿/水一次性提取细胞的水溶性及脂溶性代谢物,使用9.4T MR检测提取物的氢质子频谱,并定量计算谱线中主要代谢物的浓度。结果 hUCMSCs的水溶性与脂溶性提取物具有不同的频谱特征,水溶性提取物频谱中的主要代谢峰有乳酸、醋酸、苏氨酸、谷氨酸、肌酸、肌醇及胆碱复合物等,脂溶性谱线中主要代谢峰为长/短链脂肪酸等。结论 MRS能反映细胞的生理状态,综合分析两类提取物的频谱特征能更全面地获取间充质干细胞的代谢信息。

HPLC法测定丝裂霉素C聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒中丝裂霉素C的含量

目的:建立高效液相色谱法测定丝裂霉素 C 聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(MMC-PBCA-NP)中药物含量。方法:采用C_(18)柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以混合磷酸盐缓冲液-乙腈(85:15)为流动相,流速为1 mL·min^(-1),紫外检测器,检测波长为365 nm。结果:丝裂霉素 C(MMC)浓度在5～250 μg·mL^(-1)范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9998;平均回收率(n=6)为98.15%。结论:本法专属性强,操作简便,结果准确。适用于 MMC-PBCA-NP 的质量控制。

人脐带血间充质干细胞在缺氧缺血性脑病新生鼠脑内的定植

目的探讨脐带血间充质干细胞（MSCs）培养及其在缺氧缺血性脑病（HIE）新生鼠脑内的定植。方法用出生7 d的新生SD大鼠制作HIE模型,同时在当天分别用2种方法（定向注射和尾静脉注射方式）接受经Hoechst 33258标记24 h的MSCs移植,15~30 d观察MSCs存活情况。结果用改良Rice法可制备7日龄新生鼠单侧脑损伤为主的HIE模型;经定向注射和尾静脉注射移植的MSCs能在HIE脑内定植,分布在患侧大脑皮层、海马等部位,并主要以额叶为多,和宿主脑组织融合在一起。结论在体外培养条件下,人脐血MSCs可以生长,当MSCs移植到HIE模型鼠后,细胞能和脑实质融合在一起,并更多地向脑损伤部位迁移聚集。

乙型肝炎病毒垂直传播新途径的研究

垂直传播是指患者的生殖细胞受病毒感染 ,在受精时由精子或卵细胞作为载体 ,将病毒基因带到胚胎进而使子代患病的一种新的、尚待证实的传播方式。近年来成为相关领域的研究热点。

弱精症患者精子基因表达谱的建立及分析

背景与目的:应用基因芯片技术建立弱精症患者精子基因表达谱。材料与方法:收集30份弱精症患者精液标本和20份成年健康有生育能力男性的精液标本,提取精子RNA,制备生物素标记的cDNA探针,与含有30968个探针的PhalanxOneArrayTM芯片杂交,分析弱精症患者与健康有生育能力成年男性精子中基因的表达情况。结果:高活力精子和低活力精子共1995个基因存在表达差异,上调基因394个,下调基因437个。功能聚类分析结果提示,弱精症患者精子中表达上调的基因集中在物理化学刺激、压力应激、炎性反应等聚类,或一些催化酶聚类,这些因素可能是导致精子活力降低的重要诱因;而弱精症患者精子中表达下调的基因主要集中在一些与精子发生和抗凋亡相关的基因聚类中。结论:弱精症患者精子基因表达谱的建立对分析精子运动的分子机制和探讨弱精症的病因将会有所帮助。

pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达

目的 :构建 pEgr-P16重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导表达。 方法 :人P16cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成 pEgr-P16重组质粒 ,利用脂质体介导转染人EC9706细胞 ,用Westernblot方法检测不同剂量γ射线照射后被转染细胞中P16的表达。结果 :酶切鉴定证实 pEgr-P16重组质粒构建正确。被 pEgr-P16重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量γ射线照射后 ,P16基因表达均高于未照射组。 结论

体内诱导人脐带间充质干细胞向男性生殖细胞分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)在小鼠体内向男性生殖细胞分化的可能性。方法HUC-MSCs纯化培养后,经显微注射方法移植到不育小鼠睾丸曲细精管,对体内移植后的细胞行免疫组化、免疫荧光及激光共聚焦,观察其存活、迁移及男性生殖细胞的特异性标记物表达等情况。结果HUCMSC体内移植后免疫组化显示其在睾丸微环境中可以存活至少120 d并发生从管腔到基底膜的迁移;免疫组化、免疫荧光、激光共聚焦证明HUCMSCs移植后在睾丸微环境中可以进一步分化,表达生殖细胞特异性标记物。结论体内外定向诱导HUC-MSCs可能可以向男性生殖细胞方向分化,HUCMSCs将可能为治疗男性不育提供一种新的细胞来源,提供一条新的治疗途径。

人血树突状细胞形成细胞簇功能的体外观察

观察了分离的人外周血树突状细胞分别与同种异体淋巴细胞和淋巴因子激活杀伤细胞于37℃,5% CO_2,饱湿条件下共育形成的细胞簇,以4～25个细胞聚集计为一簇进行活细胞计数. 结果发现:经16小时培养的树突状细胞,共育24小时比共育4小时形成的细胞簇明显增加,而与共育28小时者无明显差异:培养36小时的树突状细胞与培养16小时的树突状细胞相比,共育4小时的细胞簇相应增加;培养液内加入淋巴因子激活的杀伤细胞培养上清液,细胞簇也相应增多.以上结果表明,人血树突状细胞与淋巴细胞或淋巴因子激活的杀伤细胞形成细胞簇与树突状细胞单独培养的时间、树突状细胞与淋巴细胞或淋巴因子激活的杀伤细胞共育的时间均有一定的关系.淋巴因子激活的杀伤细胞培养上清液对细胞簇形成也有一定促进作用.

乙肝病毒表面蛋白对人精子活力及线粒体膜电位的影响

目的:乙肝患者的精子活力降低且有较高比例的凋亡和坏死,但其机制未明。本研究主要考察乙肝病毒表面蛋白(HBs)对人精子线粒体膜电位的影响。方法:对经不同浓度的HBs(0、25、50、100μg/ml)孵育4h后的人精子活力进行分析,并进一步采用JC_1染料结合流式细胞术监测人精子线粒体膜电位的变化。结果:与对照组比较,人精子在体外加入100μg/mlHBs孵育后,a+b级精子数比例显著下降(P<0.01),精子线粒体膜电位显著下降,25、50、100μg/mlHBs处理组丧失线粒体膜电位的精子百分率分别为24.83%、44.43%和92.22%。结论:乙肝病毒可能通过表面蛋白HBs对人精子活力和线粒体膜电位产生负面影响。