人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的 :探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力 .方法 :从 5～ 9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞 (PGC) ,将其置于饲养层上培养 ,采用大鼠心肌细胞条件培养基 (RH CM ) ,改变了常规使用添加白血病抑制因子 (LIF)的培养液 .结果 :成功地完成了对PGC的第 4代培养 ;经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞 (ES)的特性 :AP染色呈阳性 ;体外分化实验显示此细胞具有发育多能性 ;悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB) .结论 :离散生殖嵴和增殖的PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键 ;PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显著差异 ;添加RH

人胚胎原始生殖细胞的原代培养

从 5～ 9周人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞 (PGC) ,将其置于经过丝裂霉素C处理过的单层小鼠胚胎成纤维细胞 (PMEF)饲养层上培养。结果 ,经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合小鼠胚胎干细胞 (ES)的特性 ,表现为细胞核大 ,细胞排列紧密 ,界限不清 ,集落边缘可见分化的成纤维细胞等 ;将其接种于裸鼠皮下 ,经过 2 9d生长 ,得到具有

人脐血中CD133^+血管内皮祖细胞的分离培养和生物学特性

目的:观察免疫磁珠法分离得到的CD133+血管内皮祖细胞的细胞表面标记及生物学特性。方法:实验于2002-11/2003-08在解放军第四军医大学西京医院烧伤外科实验室完成。①选取正常顺产或剖腹产人胎盘(解放军第四军医大学西京医院妇产科提供,产妇均知情同意)作为CD133+血管内皮祖细胞的标本来源。②人胎盘脐血ACD-B抗凝,稀释后取7mL脐血缓慢加入淋巴细胞分离液3mL,2100r/min离心30min,取棕黄色层低密度单个核细胞,洗涤去血小板。免疫磁珠与FITC-CD133单抗室温孵育30min,洗去多余单抗,将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入到单个核细胞中,室温孵育30min,置于磁场中1min,吸弃细胞悬液,加入磁珠-细胞分离液从免疫磁珠上释放出CD133+血管内皮祖细胞。加入EGM-2MV培养基,接种于包被I型胶原的培养瓶中,24h换液除去未贴壁细胞,3d后半量换液,培养3～4周。③观察CD133+血管内皮细胞经免疫磁珠分离后的形态变化;采用流式细胞仪分析CD133+血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞的比例及免疫磁珠的分离效率;免疫荧光及酶组织化学检测CD133+血管内皮祖细胞体外培养不同时期的表形变化;透射电镜观察成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况。结果:①CD133+血管内皮祖细胞体外培养形态观察:贴壁小细胞团在4～5d可见伪足伸出,7d后呈克隆状迅速生长,2～3周后密集区细胞呈“鹅卵石”样,培养4周融合后的细胞呈梭形。②CD133+血管内皮祖细胞分离率检测结果:CD133+血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞中的比例为0.91%,经免疫磁珠分离后比例为85.52%。③CD133+血管内皮祖细胞体外培养不同时期的免疫表形变化:培养第5天极少数细胞CD133染色阳性,大部分细胞CD34及vWF染色阳性;第10天所有细胞CD133染色均呈阴性,大部分细胞CD34、vWF染色呈阳性。④成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况:透射电镜下培养第10天可见成熟血管内皮细胞所特有的W-P小体。结论:采用免疫磁珠法可以有效地从人脐血中分离纯化CD133+血管内皮祖细胞,不同培养时期通过CD133,CD34,vWF单抗以及透射电镜进行鉴定,证明其具有分化为成熟血管内皮细胞的能力。

人脐血内皮祖细胞体内促进血管重建的实验研究

目的:通过观察人脐血内皮祖细胞(EPC)在裸鼠体内缺氧状态下分化成内皮细胞的现象,初步研究其促进血管重建的作用。方法:根据EPC表面标记CD133,采用免疫磁珠法分离培养EPC。设计EPC裸鼠成瘤实验,观察瘤体内血管增生情况;将荧光标记的EPC注射于裸鼠腹部皮瓣中,观察EPC参与皮瓣血管重建情况;将EPC接种于聚羟基乙酸(PGA)中,移植于裸鼠皮下,观察EPC参与血管重建。结果:原代EPC贴壁后呈梭形,从第7天开始数量明显增加,呈克隆状生长。透射电镜观察到成熟内皮细胞最具特征性的细胞器——Weibel-Palade小体。裸鼠成瘤实验:抗人vWF免疫荧光显示大量EPC参与肿瘤血管生成;裸鼠皮瓣实验:荧光标记EPC参与裸鼠皮瓣血管生成;PGA移植实验:抗人vWF免疫酶组织化学染色显示EPC参与血管生成。结论:EPC参与血管重建,具有促进血管新生,加速缺血组织血管化的作用。

出院者平均住院日对比分析中指数法的应用

指数是用来测定一个变量对于一个特定观察值大小的相对数，它可分析现象因素的变动关系，分析现象总变动中各因素的作用和方向，从而探寻现象变动的主要因素。“出院者平均住院日”是用来说明一定时期内每一住院者平均住院时间的长短，笔者试用指数法找出影响“出院者平均住院日”变动的主要原因。

重度烧伤并发脓毒症64例血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平测定及其相关性分析

目的:探讨烧伤脓毒症患者的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与相应治疗方案的相关性。方法:将我院收治的96例重度烧伤患者,依据并发和未并发脓毒血症分为未并发脓毒症组、脓毒症存活组和脓毒症死亡组,对重度烧伤并发脓毒症的相关因素进行分析,并采用ELISA试剂盒对三组患者治疗前后血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平进行检测,分析其与脓毒症的相关性。结果:相比未并发脓毒症组,脓毒症存活组和脓毒症死亡组患者在治疗前血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显上升(P<0.05);脓毒症存活组不同时间点的3种因子比较均有显著性差异(P<0.05),而脓毒症死亡组无显著性差异(P>0.05)。结论:烧伤脓毒症患者血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平可作为烧伤并发脓毒症及后期治疗效果的预测指标。

手背深度烧伤后指蹼外形与功能修复的美学探讨

目的:改进手背深度烧伤后指蹼区域的植皮方式,最大限度地恢复指蹼的外形及功能。方法:手术切除手背深度烧伤创面,取自体中厚皮分区移植,手背与指背区所植皮片的连接点位于第一指节的中段,使指蹼区皮片呈自然弧形与残存指蹼皮肤连接。术后10天左右拆线,出院后给予相应康复训练以保持手部及指蹼的外形和功能。结果:本组病例共40例,计48只手,植皮成活率均在95%以上,术后随访3月～2年,手背及指蹼外形良好,功能基本正常。结论:改进后的植皮方式在保证指蹼功能的基础上更有利于恢复指蹼的自然外形。

上肢深度烧伤的美容整复治疗方法初探

目的:探讨中小面积烧伤患者合并上肢深度烧伤时的手术方案,在最大限度地恢复上肢功能的同时,保持受伤肢体外形的美观。方法:对有上肢深度烧伤且皮源较充足的患者进行早期切削痂,对已形成肉芽创面者则彻底切除或削除创面及其基底板,之后取中厚皮片进行大张皮完整移植,术后10天左右更换敷料并拆线,愈后辅以弹性绷带及功能锻炼等治疗措施巩固疗效。结果:本组共10个病例,13个上肢,最大单侧肢体植皮面积9%,皮片移植的成活率均在95%以上,术后随访2～18个月,患者对功能及外形均表示满意,尚无一例行二次手术矫正。结论:对有上肢深度烧伤但皮源较充足的患者,应提倡进行大张中厚皮完整移植,在保证植皮成功率的基础上,加以术后正确的功能锻炼及弹性绷带等辅助措施,不仅可以最大限度地恢复上肢的功能,同时还可保持肢体外形的美观。

细胞松弛素B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响

目的 探讨细胞松弛素 B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响。方法 常规超排 KM小鼠获卵母细胞 ,将有明显第一极体的卵母细胞放入含有 5× 10 - 3、1× 10 - 2 、2× 10 - 2 g/ L CB的成熟培养液中孵育 15 min,采用盲吸法去核 ,去核后的卵母细胞放入含 5× 10 - 3g/ L Hoechst33342的成熟培养液中染色 15 min,在荧光显微镜下检查去核的效率。结果 CB组去核率可达 88.2 % ,而对照组去核成功率仅达 2 9.7% ,两者的去核效果统计学上有显著差异 ;同时 CB的浓度过高会影响去核的效果 ,使卵母细胞的破溃率升高。结论 CB有利于去核 ,同时卵胞膜可以借助磷脂双层的游动性而很快得到修复 ;高浓度的 CB对卵胞膜作用过于强烈 ,细胞骨架严重破坏 ,磷脂双层结构的弹性和粘性减弱 ,修复能力降低 ,影响胚胎的构建。

手部深度烧伤早期综合治疗

目的:探讨手部深度烧伤早期治疗,保护手的外观和功能的有效方法。方法:对210例(380只)手深度烧伤患者遵循"及早减压切痂,整形修复,康复训练,瘢痕防治等综合治疗"原则,采用切痂时保留间生态组织,修复时整形植皮技术,康复时有计划功能训练,瘢痕未形成时有效抑制瘢痕措施的综合治疗方法。结果:380只手均行自体中厚皮移植,除1只火焰烧伤手指远节毁损截指,其余379只手移植皮肤全部成活,按疗效评判标准[5]:优280只手占74%,良80只手占21%,差19只手占5%。结论:手部深度烧伤早期手术干预,断层中厚皮移植修复,有计划和系统的康复训练,防止瘢痕增生,全面综合的治疗方法可最大限度恢复手的功能和外形,达到接近正常。

透明质酸酶对牛卵母细胞孤雌激活的研究

在 37— 39℃ 5 0mL/LCO2 条件下 ,用含 80mL/L发情牛血清及 5 0mL/L犊牛血清的M 199成熟培养液培养牛的A、B级卵丘 卵母细胞复合体 (COCS) ,18— 2 2h后以无血清的TCM 199培养液洗涤 3次 ,用透明质酸酶消化吹打脱去卵丘细胞 ,以无血清的M 199培养液洗涤 3次 ,移回成熟培养液中培养。结果 ,卵细胞于成熟后第 3d开始出现卵裂 ,第 5d卵裂率达到 37% ,第 9d囊胚率达 5 %— 9%。表明透明质酸酶可以促使成熟的牛孤雌卵母细胞激活并发育至囊胚。

腹腔镜下切取大网膜游离移植修复肢体复杂创面

目的评估腹腔镜切取自体大网膜游离移植的方法修复四肢复杂创面的有效性。方法 11例患者(机械损伤、软组织感染坏死7例,大面积深度烧伤4例)出现大面积、不规则软组织缺损创面,深部组织、骨、关节外露。先清创予以封闭式负压引流控制创面感染,创基较为清洁后行游离大网膜加自体薄中厚皮片移植覆盖创面。结果 11例移植的大网膜均成活良好,1例一期植皮小部分坏死,后经二期植皮封闭创面。术后3-12月随访,外观及功能良好。结论当出现肢体、躯干大面积缺损、感染的四肢复杂创面无法以常规的皮瓣移植修复时,可选用腹腔镜下切取自体大网膜、皮片游离移植的方法进行修复。

正常人皮肤深Ⅱ度烫伤动物模型的建立

利用正常人皮肤裸鼠移植模型,建立一种深Ⅱ度烫伤动物模型。首先将正常人全厚皮肤移植于裸鼠背部,待皮片完全成活后,用高压蒸气消毒锅及自制蒸气烫伤装置,以压力0.12MPa、直径1.5cm在裸鼠背部植皮区作用8s,分别于伤后24h、2、4、6周取标本行组织学观察,观察毛囊、汗腺等皮肤附件的损伤程度、创面愈合时间及被毛生长等情况。结果表明,正常人全厚皮肤于移植后2周完全成活,具有正常的组织结构;高压蒸气作用8s,可造成所移植皮肤组织的深Ⅱ度烫伤,创面于伤后3周愈合,6周后有少量被毛生长。该模型可成功复制正常人皮肤深Ⅱ度烫伤创面,为研究创面愈合过程中皮肤附件的病理变化提供了实验工具。

延期皮肤移植术在面颈部畸形修复中的应用

目的:探讨并比较面颈部大范围自体皮移植手术中,延期手术与一次手术的成功率及愈后效果。方法:针对面颈部瘢痕、巨痣等在实施大面积自体皮移植手术时,手术分两种术式进行:一期术式即切除病变组织后立即行自体皮移植;延期术式则先行常规病变组织切除,包扎创面后48h再进行自体皮移植。术后交换敷料时间均为术后第7天,观察比较两种术式在皮片成活率、创面感染发生率、皮下血肿发生率、瘢痕增生发生率等方面的差异,以及患者治疗周期及治疗费用上的差异。结果:本组病例共49例,行一期术式者13人,行延期术式者36人,在皮片成活率(91.9%±4.5%vs99.5%±1.2%)、皮下血肿发生率(92.3%vs22.2%)、感染发生率(7.7%vs2.8%)方面,二者有显著性差异(P<0.05)。两组在治疗周期上无显著性差异。治疗费用方面,延期手术组略高。随访结果显示,两组远期效果基本类似,但一期术式组的瘢痕形成及增生情况多于延期术式组。结论:面颈部实施大范围自体皮移植手术时采取延期植皮的方式,对保证手术的成功及愈后效果有重要作用。

注核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的 :探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠 -小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步化处理的 SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞 ,常规超排 KM小鼠获得卵母细胞 ,采用盲吸法去核 ,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎 ,6- DMAP+ CCB+乙醇激活重组胚 ,CZB培养液中培养。结果 :电场强度 ( V/cm)和脉冲 ( ms)为 :1 5 0 0 /30 ;1 5 0 0 /40 ;1 80 0 /30 ;1 80 0 /40时 ,融合率为 :81 .5 % ;83.3% ;77.6% ;82 .0 %。直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为 33.1 %和 2 8.9% ,桑椹胚发育率为 1 7.8%和 1 5 .5 %。结论 :电场强度为 1 5 0 0～ 1 80 0 V/cm,脉冲为 30 ms或 40 ms时 ,都能获得较高的融合率 ;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高 。

锅炉用钢材强化规律的实验研究

通过对六种锅炉用钢材的实验研究,得到了材料屈服的一些特点,给出了在沿一定加载路径的拉压循环载荷作用下材料的强化规律,以及在拉伸和压缩时材料所表现出的不同性质。

毛囊与体表来源上皮细胞的生物学差异

目的:观察毛囊及表皮来源上皮细胞之间的生物学差异,探讨其在创面愈合中的不同作用.方法:体外分离培养成人头皮毛囊及肢体皮肤来源的上皮细胞,通过β1整-合素及keratin15染色鉴定、细胞生长曲线测定、细胞克隆形成率比较及流式细胞仪分析等方法,比较两种细胞在细胞表面标志物、生长增殖、细胞周期等方面的生物学差异.结果:毛囊来源的上皮细胞的β1-整合素及keratin15染色均可见明显的阳性细胞,而体表皮肤来源的上皮细胞则多为阴性;在细胞的生长增殖方面两者存在一定的差异,但无统计学意义;细胞周期分析表明,毛囊来源的上皮细胞处于DNA合成期的细胞数明显高于体表皮肤来源的上皮细胞(23.44%vs11.33%,P<0.05);毛囊来源的上皮细胞的克隆形成率为15.3%,后者为6.7%,差异显著.结论:毛囊来源的上皮细胞在增殖潜力方面明显高于体表皮肤来源的上皮细胞,在创面愈合中可能起主导作用.

自体细胞来源的组织工程皮肤及其实验研究

利用患者自体来源的皮肤细胞,在经过短时间的体外培养后构建组织工程皮肤,并对其移植后的转归进行动物实验观察。分离培养头皮中的角质形成细胞及创面来源的成纤维细胞,并在体外进行传代扩增。利用三维立体培养系统构建复合细胞膜片,移植于裸鼠背部全层缺损创面,以单层细胞膜片为对照,对其转归进行大体及病理学观察。体外分离培养的皮肤细胞在体外扩增2周后即可用于构建复合细胞膜片,在移植覆盖裸鼠全层皮肤创面后,伤口愈合良好,移植2月后的病理结果显示皮肤结构明显优于单层膜片移植。证明利用患者自体来源的皮肤细胞可快速构建组织工程皮肤,有望成为治疗大面积深度烧伤患者的途径之一。

脐旁岛状皮瓣修复髂腹部游离皮瓣供区的方法

目的:介绍脐旁岛状皮瓣修复髂腹部游离供瓣区封闭方法及临床应用。方法:临床12例患者,髂腹部游离皮瓣切取后,供瓣区难以直接缝合,采用邻近的脐旁岛状皮瓣修复封闭创面。结果:术后脐旁岛状皮瓣成活良好,切口一期愈合。结论:采用本方法腹部外观及功能恢复良好,部分肚脐轻微牵拉,后期疤痕轻。