陆川猪MyoD1基因克隆及组织表达分析

为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C_(1457)H_(2296)N_(442)O_(471)S_(14);不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

基于转录组测序的巴马香猪和杜洛克猪骨骼肌差异lncRNA分析

【目的】通过对巴马香猪和杜洛克猪背最长肌组织进行转录组测序鉴定差异表达lncRNA,筛选与骨骼肌发育形成相关的候选基因,为明确lncRNA对骨骼肌生长发育的调控机制提供理论基础。【方法】采集12月龄的巴马香猪和杜洛克猪背最长肌组织进行转录组测序,以错误发现率(FDR)<0.05且|log2Fold Change|>1为标准筛选差异表达基因(DEGs)和差异表达lncRNA,并进行实时荧光定量PCR验证,预测差异表达lncRNA靶基因并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,选取表达差异最大的lncRNA构建其与靶基因互作网络。【结果】在巴马香猪和杜洛克猪背肌间共鉴定出6316个DEGs和675个差异表达lncRNA;GO功能注释分析结果表明,差异表达lncRNA靶基因主要涉及代谢过程、肌肉组织发育及骨骼肌细胞增殖和分化等生物过程;KEGG信号通路富集分析结果表明,差异表达lncRNA靶基因在Hippo和Wnt信号通路显著富集(P<0.05),说明差异表达lncRNA与骨骼肌细胞的增殖、自噬和分化相关;对表达差异最大的lncRNA-MSTRG.16703进行实时荧光定量PCR验证,发现其在巴马香猪中的相对表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),与转录组测序结果一致。lncRNA-MSTRG.16703与靶基因互作网络分析结果表明,上调靶基因包括QKI、MBNL1和YBX2,QKI和MBNL1在均与可变剪接相关。【结论】在巴马香猪和杜洛克猪间发现的差异表达lncRNA是调控骨骼肌发育的候选基因,其靶基因主要富集在Hippo和Wnt等骨骼肌发育相关信号通路。lncRNA-MSTRG.16703的表达差异最大且在巴马香猪中上调,其靶基因在骨骼肌细胞增殖分化和肌纤维形成中有重要调控作用。

杜洛克与陆川猪正反交对后代繁殖性能和屠宰性能的影响

研究旨在探索杜洛克猪和陆川猪正反交对后代繁殖性能和屠宰性能的影响,为杜洛克猪和陆川猪杂交系的选育工作提供依据。试验通过正交试验(杜洛克♂×陆川猪♀)和反交试验(陆川猪♂×杜洛克♀)分别获得杜陆猪(DL)和陆杜猪(LD),在杜陆猪和陆杜猪中分别进行横交试验,记录母猪的窝产仔数、窝产活仔数、产仔异常数、出生窝重、28日龄断奶数和28日龄断奶窝重等繁殖性能指标。并对杜陆猪和陆杜猪的胴体重﹑屠宰率﹑胴体长﹑背膘厚﹑眼肌面积、瘦肉率等屠宰性能指标进行测定。结果表明,正反杂交后代的繁殖性能、肉色和肉质嫩度显著优于杜洛克猪,屠宰性能指标显著高于陆川猪。在猪肉嫩度方面,陆杜猪显著优于杜陆猪。可见,杂交后代都同时遗传了陆川猪和杜洛克猪的优良性状,这为杜洛克猪与陆川猪的杂交系选育提供了依据。

沼泽型水牛发情期血清生殖激素的变化规律研究

研究应用RIA法对沼泽型水牛发情期的血清生殖激素浓度进行测定,并分析了生殖激素的变化规律。结果表明:①同期发情的水牛在处理后至发情当天均有2个E2峰出现,第1个在发情前,第2个在发情后并与LH峰同时或之前2 h;②PMSG(肌注)+PG(肌注)处理的水牛出现发情前E2峰、发情后FSH峰和LH峰的时间为处理后24、60 h和63 h,而PMSG(肌注)+PG(子宫灌注)+LH(肌注)处理的水牛出现发情前E2峰、发情后FSH峰和LH峰的时间为处理后48、80 h和82 h;③各组水牛P4水平在发情后48 h内均低于0.8 ng/mL;④与自然发情水牛对比,同期发情处理可显著影响其发情期的FSH和LH内源性分泌水平(P<0.05);而对E2和P4均没有产生显著性的变化(P>0.05)。

水牛精原细胞的体外培养及分化

以探讨水牛精原细胞体外培养的发育潜能为目的,对3～5月龄水牛睾丸组织进行精原细胞与支持细胞的体外共培养。两步酶法消化睾丸组织来制备水牛生殖细胞悬液,接种于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养30d,观察细胞的生长和形态变化,并对培养4周的细胞进行RT-PCR分析,以检测PRM-2和TP-1基因的表达情况。结果显示,水牛精原细胞体外培养24h后,精原细胞(10.0～12.5μm)呈圆形并紧贴支持细胞上;培养7～8d后,精原细胞出现聚集状态;培养10d后,有细胞克隆形成;培养30d后,出现似长形精子细胞(8.0～10.0μm)。对培养4周后的细胞进行RT-PCR分析,精子细胞特异表达基因PRM-2被检测出来。结果表明,采用本试验体外培养条件对水牛精原细胞进行培养,能够满足精原细胞体外长期培养的需要,并可以发生增殖与分化而形成似精子细胞。

丙戊酸处理对猪手工克隆重构胚体外发育潜能的影响

为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对猪手工克隆(HMC)胚胎发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0、25、50、75和100nmol/L)VPA处理猪HMC重构胚对后期胚胎发育率、内细胞团数和组蛋白乙酰化程度的影响。结果表明,50、75nmol/L VPA处理组HMC重构胚的卵裂率和囊胚发育率均显著高于0、25和100nmol/L VPA处理组(P<0.05);与0、25、75和100nmol/L相比,50nmol/L VPA处理组能显著提高囊胚内细胞团细胞数(P<0.05),囊胚阶段VPA处理组的组蛋白H3K14乙酰化(AcH3K14)水平高于空白组和孤雌激活囊胚。因此,应用VPA处理可提高猪HMC重构胚胎分裂率、囊胚率及增加内细胞团细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。

猪不同发育阶段肠道微生物菌群特征分析

为研究不同生长发育阶段猪肠道微生物菌群结构与特征的差异,本研究将50头28日龄体重8 kg左右的杜×长×大断奶仔猪随机分为5栏,分别在第60、90、120、150、180日龄饲喂前,从每栏随机挑选5头猪,每头采取100 g左右的新鲜粪样,采用16S rRNA高通量测序技术对微生物多样性进行研究。结果显示:通过菌群分类学分析发现,不同时期猪肠道微生物分布于22个门、42个纲、74个目、119个科、321个属和579个种,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)、螺旋体门(Spirochaetae)为主要优势菌门,不同时期的特异菌群显著差异;对丰度值前30的肠道菌群与血液免疫抗体浓度进行相关性关联分析发现,IL-2浓度与12个菌群存在显著相关性,IL-6浓度与14个菌群存在显著相关性,IgG浓度与12个菌群存在显著相关性,IgM浓度与11个菌群存在显著相关性,IgA浓度与26个菌群存在显著相关性。综上表明,猪肠道微生物菌群结构与组成在不同生长发育阶段均存在显著差异,对猪免疫性能具有重要作用。

饲用桑茎叶粉对肉兔生产性能、生化指标及肉品质的影响

试验旨在研究饲用桑茎叶粉对肉兔生产性能、血清生化指标和肉品质的影响。采用单因素试验设计,选择健康、体重接近的新西兰肉兔100只,随机分为4组(每组5个重复,每个重复5只)。对照组肉兔饲喂基础日粮,5%、10%和15%试验组分别用5%、10%、15%的桑叶粉代替基础日粮。预试期7 d,正式试验期60 d。结果显示,试验组肉兔平均日增重显著低于对照组(P<0.05),试验组肉兔料重比显著高于对照组(P<0.05)。15%试验组肉兔全净膛率和半净膛率显著高于对照组(P<0.05)。试验组肌肉pH值显著高于对照组(P<0.05),5%试验组肌肉蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05),10%试验组肌肉脂肪含量显著高于对照组(P<0.05),15%试验组在肉色L^(*)、a^(*)、b^(*)显著高于对照组(P<0.05)。试验组肉兔血清总胆固醇的含量低于对照组,血清中免疫球蛋白G(IgG)、补体C3、补体C4含量高于对照组。试验组肌肉氨基酸总量、必需氨基酸含量、风味氨基酸含量高于对照组,10%试验组和15%试验组于对照组间差异显著(P<0.05),10%试验组不饱和脂肪酸含量显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,饲粮中添加10%~15%饲料桑茎叶粉能提高兔肉肌肉中风味物质的含量,改善肉品质。

陆川猪与杜洛克猪正反交F1代UCP3基因表达差异研究

为培育优质猪品系,提高猪肉品质,本试验探索了陆川猪与杜洛克猪正反交F1代及其亲本陆川猪肌内脂肪含量和UCP3基因表达差异。试验分别选取陆川猪、陆川猪与杜洛克猪正反交F1代各8头,采用实时荧光定量RT-PCR方法测定肌肉中UCP3基因mRNA在不同品种猪中的表达量,并测定眼肌面积和肌内脂肪含量,以分析UCP3基因的表达量与脂肪和眼肌面积的相关性。结果显示,3组猪在眼肌面积、肌内脂肪含量和UCP3基因mRNA表达量上均差异显著(P<0.05),且正反交F1代均遗传了杜洛克猪体型大、陆川猪肌内脂肪含量高的优势,UCP3基因的表达量与猪眼肌面积呈极显著负相关,与肌内脂肪含量呈极显著正相关。初步推断UCP3基因可作为影响猪脂肪性状的主效基因。

水牛Follistatin cDNA克隆及序列分析

卵泡抑素(Follistatin,FS)可通过旁分泌和自分泌的方式抑制促卵泡素(FSH)的分泌,从而影响动物的繁殖机能。本研究拟通过分析水牛的FS cDNA序列来分析其繁殖性能低的可能原因。试验参照GenBank公布的奶牛的FS cDNA序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增目的基因,再将其亚克隆到pMD-18T克隆载体进行测序。测序结果显示本试验成功获得了水牛的FS cDNA序列。同源性及进化树分析提示FS在哺乳动物进化上高度保守。研究发现两处氨基酸的突变,这可能影响FS正常的生物学功能发挥,从而影响水牛的繁殖机能。

陆川猪与杜洛克杂交猪的屠宰性能和肉质性状分析

以广西地方品种陆川猪为父本,外种猪杜洛克为母本,通过杂交、横交和闭锁繁育的方式培育优良肉质杂交猪新品系。经过2个世代选育所得结果为:陆杜猪二世代90 kg活体的胴体瘦肉率达到54.58%,较一世代提高了8.57%;二世代平均背膘厚为2.06 cm,较一世代降低了10.82%;二世代眼肌面积为30.85 cm^2,较一世代提高了5.36%;二世代肌肉水分含量为74.30%,显著高于一世代的72.37%;二世代肌内脂肪达到4.16%,高于一世代;陆杜猪二世代肌肉剪切力为30.79 N,较一世代下降了20.46%。综合分析试验结果,二世代的屠宰率、胴体瘦肉率、眼肌面积、肌肉水分、肌内脂肪等指标较一世代有所提高,而平均背膘厚、肌肉剪切力则有较大程度降低,这表明世代选育后的陆杜猪具有优良屠宰性能且肉质鲜嫩,适合用于优良肉质猪配套系生产。

饮水中添加复合益生菌对仔猪生长性能及免疫指标的影响

为进一步研究益生菌对仔猪生长性能、腹泻率和血清生化指标、免疫指标的影响,选取1000头健康状况良好、平均始重(8.31±0.33)kg、(35±2)日龄的三元杂交断奶仔猪,随机分成对照组和试验组2组,对照组不添加任何益生菌和抗生素,试验组每1000 kg饮水中添加1 L的益生菌。结果表明:饮水中添加复合益生菌能够较好地改善仔猪的生长性能,提高仔猪的日增重,降低料重比(P<0.05),降低仔猪腹泻率(P<0.05),提高仔猪的免疫力(P<0.05)。

马尾藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

就马尾藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响进行了探索。试验 1证明 ,体外培养时 ,成熟液添加马尾藻类多糖能促进卵丘细胞扩展 ,成熟培养 4 7～ 4 8h,添加 2 0 g/ L 马尾藻类多糖能提高核成熟率 (41.8% ) ,与对照组2 9.3%的核成熟率相比 ,二者差异显著 ;试验 2证明 ,进行化学联合激活时 ,添加 2 0 g/ L马尾藻类多糖 (未添加 L H)可获得 6 0 .4 %孤雌激活分裂率 ,显著高于对照组 4 2 .6

猪成纤维细胞转染方法的比较

以EGFP为报告基因,比较脂质体法与磷酸钙法对广西陆川猪胎儿成纤维细胞进行转染的效率。结果发现:利用脂质体法、磷酸钙法转染35 mm培养皿培养的细胞,分别得到15、13个阳性细胞集落。利用2种方法对猪胎儿成纤维细胞进行转染均可行。

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906bp处为同义突变,110和278bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。

广西2个地方猪种与杜洛克猪杂交后代生长及繁殖性能分析

[目的]研究杜洛克猪和环江香猪、隆林猪杂交后代的繁殖性能和生长性能,为优良性状新品系猪的选育工作提供基础依据。[方法]通过杜洛克猪♂×环江香猪♀和杜洛克猪♂×隆林猪♀杂交分别获得杂交后代杜香猪和杜隆猪,测定杜香猪、杜隆猪的体长、体高、胸围、腹围、体重等生长性能,记录母猪窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重及其仔猪30日龄断奶头数、30日龄断奶窝重等繁殖性能。[结果]杜香猪和杜隆猪的生长性能和繁殖性能均较优良,杂交后代集中了环江香猪、隆林猪和杜洛克猪的优良性状。[结论]利用广西地方猪种来培育优良性状新品系猪,环江香猪和隆林猪可作为良种的二元杂交母本使用。

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。

性别对杜陆猪肉品质及风味影响的代谢组学分析

试验旨在了解不同性别杜陆猪不同组织的代谢差异及这些代谢差异对肉品质和风味产生的影响,为性别因素对猪肉品质和风味研究方面的影响提供基础代谢依据。试验选取16头(公母各半)8月龄、体重相近的杜陆猪,采用气相色谱质谱联用技术(GC/MS)对公猪和母猪血液、肝脏、背最长肌组织代谢物进行非靶向代谢检测,并运用代谢组学分析技术进行代谢模式差异分析、差异代谢物筛选和差异代谢物代谢通路富集分析。结果表明,性别对杜陆猪血液、肝脏、背最长肌组织总体代谢模式有一定的影响;性别差异引起的血液和肝脏差异代谢物数量较多,背最长肌最少。公猪血液多数脂类差异代谢物浓度显著高于母猪(P<0.05),而肝脏则相反(P<0.05)。公猪血液和肝脏糖类差异代谢物浓度多数显著高于母猪(P<0.05),其中公猪血液2-十八烯酸单甘油酯、二十二酸、胆固酮、二氢胆固醇的含量均为母猪的1.5倍以上;公猪肝脏β-龙胆二糖的含量是母猪的29倍,L-犬尿氨酸的含量是母猪的11倍,L-酪氨酸的含量是母猪的3倍。杜陆公猪肝脏硫辛酸含量显著低于母猪(P<0.05),是母猪的50%。杜陆公猪、母猪血液和肝脏激素类、脂类、糖类、氨基酸类代谢通路均差异显著(P<0.05)。以上结果表明:杜陆猪血液、肝脏、背最长肌组织代谢物性别效应不同;杜陆猪血液和肝脏激素类、脂类、糖类、氨基酸类代谢通路均存在性别效应,但性别效应微弱。杜陆公猪血液、肝脏和背最长肌较高水平的脂类和糖类代谢物使其肉质和风味比母猪稍好。

杜洛克与陆川猪正反交后代背最长肌营养成分及氨基酸含量的比较

试验通过杜洛克猪与陆川猪的正反交试验分别获得杜陆猪和陆杜猪,并测定了体重为90 kg杜陆猪和陆杜猪背最长肌的常规营养成分及其氨基酸含量等指标。结果发现,每100 g猪肉中,陆杜猪中能量和干物质含量显著高于杜陆猪(P<0.05);杜陆猪中蛋白质和水分含量较高于陆杜猪,但两者之间差异不显著(P>0.05);杜陆猪和陆杜猪中灰分含量无显著差异(P>0.05);肌肉中17种氨基酸总量、必需氨基酸含量、鲜味氨基酸含量、必需氨基酸占氨基酸总量比例、鲜味氨基酸占氨基酸总量比例等指标,在杜陆猪和陆杜猪中比较均没有显著性差异(P>0.05)。结果表明,杜洛克猪与陆川猪正反交后代中,其肌肉中氨基酸含量差异不大,但杜陆猪肌肉中含有较高的蛋白质营养价值,这为杜洛克猪与陆川猪的杂交系选育提供了依据。

水牛支持细胞体外分离及培养

试验探讨了水牛(Bubalus bubalus Linnaeus)睾丸支持细胞(Sertolicell,SC)的分离、纯化以及培养过程中的形态学特性。结果发现,采用差异黏附培养法和高温培养法(38.5℃培养24h)纯化后,支持细胞的纯度达到了90%,说明差异黏附培养法和高温培养法均可用于纯化水牛睾丸支持细胞。