不同人群血清中抗透明带抗体的检测

为了探讨抗透明带抗体的临床意义 ,本研究用纯化的猪卵透明带ZP3抗原制备抗卵透明带抗体酶联免疫检测试剂盒 ,采用ELISA方法检测不同人群血中抗透明带抗体 ,并用阳性血清与人卵巢组织切片进行免疫组化分析。结果显示不同年龄组妇女抗透明带抗体阳性率差异不显著 (P >0 0 5 ) ,不孕组阳性率 15 % ,与其他组相比有显著性差异 (P <0 0 5 )。ELISA检测到的透明带抗体阳性血清不与人卵巢组织切片中的透明带产生肉眼可见的沉淀反应。除了早孕组和老龄妇女 ,任何年龄阶段的女性均可出现抗透明带自身抗体 ,鉴于这些抗体不引起周期紊乱现象 ,却可能阻止受精 。

一种快速筛选巴氏毕赤酵母高表达克隆的新方法

目的:为了准确、快捷地筛选到高表达的毕赤酵母工程菌株。方法:利用毕赤酵母的生理特点和免疫印迹的特异性,将转化子接种到MM板上至形成克隆,贴上NC膜,待NC膜被分泌产物湿润后,揭下NC膜,进行ELISA-dot鉴定,选出高表达克隆进行扩增、培养,并作SDS-PAGE和Westernblotting进一步确定。结果:该法的筛选结果与SDS-PAGE和Westernblotting相符。结论:与传统方法相比,该法具有高通量,快速,简便的优点,适合毕赤酵母工程菌株的筛选。

不孕妇女血清中卵透明带抗体的检测

利用与人卵透明带有交叉免疫反应的猪ZP3抗原，建立起不孕妇女血清卵透明带抗体检测的ELISA技术，并对120例不孕妇女血清进行了检测，发现15例透明带抗体阳性血清。该法灵敏、特异，稳定性和重复性好，易于在临床推广应用。

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽 (rHCMVp) ,根据其基因序列 ,设计引物从pPIC9K rHCMVp上扩增得到目的基因片段 ,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33细胞中 ,筛选获得表达量较高的重组菌株 ,研究了该菌株生长的培养条件 ,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。 2L发酵罐进行了高密度发酵 ,经 1 %的甲醇、pH6 0的条件下诱导48h ,最终菌体密度OD60. 0 达到 1 80 ,每升发酵液中含目的蛋白 78. 7mg ,产量比摇瓶提高了 4 8倍。rHCMVp可通过高密度发酵大量获得。

重组人卵透明带蛋白(rhZP3)的生物活性研究

为了研究毕赤酵母表达的重组人卵透明带蛋白(rhZP3)的生物活性,分别用空白培养液,含孕酮或rhZP3的培养液对人精子进行顶体诱发实验,用考马斯亮蓝染色法对顶体状态进行评价;用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理精子,然后再与卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子在精卵结合中的情况;用抗rhZP3抗血清与阴性血清分别处理卵子,再与精子进行结合实验,观察经过不同处理后的卵子在精卵结合中的情况。rhZP3诱发顶体反应实验结果显示,rhZP3处理组与空白对照组之间差异显著(P<0.01);精卵结合实验结果显示,各实验组和对照组之间存在显著性差异(P<0.01),rhZP3、抗rhZP3抗体均能抑制精卵结合。实验结果表明,rhZP3具有天然人卵透明带蛋白相似的活性。

围着床期小鼠胚胎表达肿瘤易感基因101(TSG101)

揭示肿瘤易感基因101(TSG101)在围着床期胚胎中的时空表达型。方法:收集囊胚、培养获得着床前、着床后以及长开的小鼠胚胎。利用全胚原位杂交以及全胚免疫染色方法检测围着床期小鼠胚胎中TSG101的时空表达型。结果:TSG101表达于围着床期胚胎的內细胞块和滋养层细胞中,其中内细胞块细胞中的表达更强。结论:围着床期胚胎表达TSG101,暗示TSG101在胚胎着床过程中发挥作用。

蛋白质快速定量法及其在rhZP3纯化中的应用

目的 建立层析过程中洗脱峰蛋白质含量的快速定量法。方法 利用蛋白质的紫外吸收原理和层析软件的积分功能,即A2 80 和峰面积计算层析过程中洗脱峰蛋白质含量。结果 洗脱峰大小与蛋白质含量呈线性关系,洗脱峰蛋白质含量可用方程X =Y A进行估算,X为待测蛋白含量(mg) ,Y为洗脱峰面积(mAU×ml) ,A为1g L待测蛋白在层析系统的紫外吸收值(mAU)。将其应用于重组人卵透明带ZP3蛋白(rhZP3 )的纯化,用该方程估算的纯化蛋白含量与用Low ry法测定结果相似。结论 该法简便、快速、重复性好,具有一定实用价值。

中枢免疫耐受缺损模型的构建

目的构建基于shRNA介导的中枢免疫耐受缺损模型。方法分离妊娠后13.5 d的胎鼠胸腺,除去淋巴细胞,获得原代胸腺基质细胞,利用慢病毒将小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒(LV-T6-shRNA)导入原代胸腺基质细胞中,重新聚集这些胸腺基质细胞得到LV-T6-shRNA重塑胸腺,将此重塑胸腺移植入无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下,饲养8周。结果慢病毒可有效转导LV-T6-shRNA慢病毒质粒入原代胸腺髓质上皮细胞中;移植LV-T6-shRNA重塑胸腺的小鼠饲养8周后,胸腺明显较小,成熟的胸腺髓质上皮细胞减少,脾脏肿大,脾脏中活化的T淋巴细胞增多,肺脏中出现淋巴细胞浸润等现象,这些表现型与TRAF6-/-小鼠的表现型相似。结论中枢免疫耐受缺损模型构建成功。

重组人卵透明带蛋白(rhZP3)对人精子顶体反应的诱导作用

目的:观察重组人卵透明带蛋白(rhZP3)对人精子顶体反应的诱导作用。方法:正常生育力人精子经过获能后,分别用BSA、孕酮和含不同浓度的重组人ZP3蛋白的培养液共孵育,诱导精子顶体反应,对实验组和对照组的精子的顶体发生状态用考马斯亮蓝染色法进行评价。结果:精子与培养液共孵育30 min后,rhZP3组与BSA组之间差异有显著性(P<0.05),顶体反应率随rhZP3质量浓度增加而升高。结论:重组人ZP3蛋白对人精子顶体反应有显著的诱导效应,且在一定范围内与质量浓度成正相关,重组人ZP3蛋白具有发展精子顶体反应试剂盒的潜能。

55K猪卵透明带抗原(ZP_3)的分离纯化

为了获得足量的猪卵透明带55K组分(ZP_3),以便研究其在高等灵长类恒河猴的免疫抗生育效果、生化和免疫学特性,我们根据国内条件建立了一套从猪卵巢分离纯化透明带55K组分的方法,该法包括用排刀切割卵巢回收卵子,热溶提取卵透明带组分(SIZP),Sephacryl S-400柱层析和Hydroxylapatite(HTP)柱层析分离纯化ZP_3、ZP_3的复性等步骤。采用本法,获得了在SDS-PAGE图谱上呈单一蛋白染色带并保留其抗原性的ZP_3纯品。每2000个猪卵巢可得ZP_3纯品10mg以上。

应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析猪和鱼卵透明带抗原的生化特性

应用高分辨率的双向聚丙烯酞胺凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）对猪和鱼卵透明带（ＺＰ）抗原蛋白的生化特性进行了比较分析．实验结果表明，热溶性猪卵透明带在２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱上显示出三个主要的ＺＰ蛋白（ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３）．其表观相对分子质量分别为：ＺＰ１：９．３×１０４～１．２×１０５；ＺＰ２：７．０×１０４￣９．５×１０４；ＺＰ３：５．５×１０４￣９．３×１０４这３组蛋白都有广泛的电荷和相对分子质量上的不均一性，这是翻译后修饰的结果．热溶性鱼卵透明带在２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱上也可见三个主要ＺＰ蛋白，其表观相对分子质量分别为ＦＺＰ１：８．２×１０４；ＦＺＰ２：３．１５×１０４；ＦＺＰ３：２．４５×１０４．它们也与猪ＺＰ一样，具有电荷不均一性，但其变化范围窄得多，说明鱼ＺＰ的翻译后修饰比较少．

SPDP蛋白偶联技术在抗原构建中的应用

为了制备多功能复合避孕疫苗，利用异型双功能试剂N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）-丙酸酯（SPDP）对复合抗原的构建进行了试验。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）结果表明抗原的偶联是成功的。葡萄球菌A蛋白（SPA）和牛血清白蛋白（BSA）被偶联到同一载体破伤风类毒素（TT）上，复合抗原的平均表观相对分子质量为3.4×105。该法有可能用于制备多功能复合抗原。

重组人卵透明带蛋白及其多克隆抗体对精子-透明带结合的影响

为了探讨毕赤酵母表达的重组人卵透明带ZP3蛋白(recombinant human zona pellucida-3 protein,rhZP3)及其多克隆抗体对小鼠和人精卵结合的影响,采用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理小鼠精子,然后再与小鼠卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附及体外受精率的影响;用rhZP3以及空白培养液分别处理人精子,然后再与人卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附的影响;用抗rhZP3抗体与阴性血清分别处理小鼠和人卵子,再与精子进行结合实验,观察多克隆抗体对精子粘附以及小鼠体外受精率的影响。实验结果表明,rhZP3和抗rhZP3多克隆抗体既能抑制人的体外精卵结合,也能抑制小鼠体外精卵结合,提示rhZP3具有天然透明带的特性,有发展成避孕疫苗和作为检测透明带抗体检测试剂的可能。

应用免疫印渍法检测猪和鱼卵透明带抗原的免疫交叉反应性

为了研究猪和鱼卵透明带抗原的免疫交叉反应性，应用免疫印渍术对其抗原组分进行了检测．实验结果表明，鱼卵透明带抗原与已知具有精子受体活性的猪ＺＰ３抗原，甚至猪全ＺＰ抗原均没有交叉反应．提示鱼卵透明带不含有与猪和人等哺乳类的透明带免疫学相类似的抗原决定簇．

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P .pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段 ,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列 ;扩增片段插入表达载体pPIC9K中 ;线性化后的重组质粒转入P .pastoris中 ,用高浓度G4 18筛选高拷贝菌株 ,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果发现P .pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中 ,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应 ,证实表达的目的蛋白具有反应原性。

骨髓间充质干细胞对免疫损伤卵巢的修复作用

目的探讨骨髓间充质干细胞移植对免疫损伤卵巢的修复作用。方法 6～8周龄的野生型健康ICR雌性小鼠随机分为3组,每组各12只。A组不作任何处理,B、C组利用猪卵巢蛋白主动免疫建立免疫损伤卵巢模型。而后C组腹腔移植来自GFP转基因小鼠的骨髓MSCs细胞,A、B组各注射等体积的PBS。MSCs移植后按既定时间处死小鼠,利用PCR检测卵巢中GFP基因以判断MSCs是否到达卵巢;通过对卵巢组织切片HE染色以及细胞凋亡分析来检测MSCs是否对免疫损伤卵巢有修复作用及其机制。结果 PCR结果表明MSCs经腹腔移植可直接到达免疫损伤卵巢;MSCs移植可促进免疫损伤卵巢组织的修复;相应地,移植组颗粒细胞的凋亡比非移植组明显减少。结论腹腔移植MSCs可促进免疫损伤卵巢的修复,其机制可能与减少颗粒细胞凋亡有关。