易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒的纯化

目的:探索针对易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒(VLP)的有效纯化方案。方法:培养的大肠杆菌经IPTG诱导重组HBcAg蛋白的表达,菌体超声破碎后的离心沉淀用含有不同浓度尿素的PBS缓冲液重悬溶解,经密度梯度离心并结合电镜观察对VLPs行为进行分析鉴定。以Sepharose 4 FF凝胶过滤层析在选定的尿素条件下纯化沉淀溶解液,纯化获得的目的蛋白进一步在含30%山梨醇的PBS中脱盐去除尿素。整个过程以SDS-PAGE及电镜进行各步骤样品中目的蛋白的分析。结果:含有1mol/L尿素的PBS缓冲溶液重悬超声沉淀,可有效溶解聚集的VLPs,在蔗糖密度梯度离心中显示典型HBcAg VLPs的行为,且电镜观察颗粒形态结构完整。经1mol/L尿素下凝胶过滤,VLPs进一步获得纯化。在脱尿素过程中流动相采用含30%山梨醇的PBS,有效避免了VLPs在尿素去除后重新聚集。结论:尿素与山梨醇的联合应用,为具有聚集现象的VLPs纯化制备提供了一种有效解决方案。

序列优化的小鼠IL-33基因在哺乳动物细胞中的有效分泌表达

目的:白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(m IL-33)的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的m IL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的m IL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别构建到双表达单元质粒p Bud CE4. 1的不同启动子下;重组质粒经lipofectamine 3000和PEI转染293FT细胞;以Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的m IL-33刺激巨噬细胞Raw264. 7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性。结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高; Western blot和ELISA结果显示密码子优化的m IL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下m IL-33在293FT细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导m IL-33的分泌,产物具生物学活性。结论:密码子优化操作显著改善了m IL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础。

呈递预测的小鼠OX40胞外域抗原表位重组病毒样颗粒的制备

目的制备呈递预测的小鼠OX40胞外域抗原表位重组病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为进一步以主动免疫方式靶向OX40调控T细胞免疫功能奠定基础。方法通过抗原数据库中氨基酸的出现频率,对肽段氨基酸组成进行分析,获得其作为抗原表位的潜能,从而预测潜在的OX40线性B细胞表位;经基因重组技术将抗原表位插入至乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)的优势表位区域,在大肠埃希菌中表达,超声裂解菌体,上清中目的蛋白经硫酸铵沉淀及Sepharose 4 Fast Flow凝胶层析纯化,沉淀中目的蛋白经2%TritonX-100洗涤、尿素溶解及脱盐纯化,获得的蛋白经电镜观察VLPs形态。将VLPs经皮下免疫小鼠,ELISA法检测血清特异抗体水平。结果经分析预测获得7个潜在的抗原表位;嵌合表位的重组HBcAg蛋白(P1~P7)在大肠埃希菌中均获得了有效表达,其中P3、P6和P7蛋白存在于超声裂解菌体的可溶性上清中,而P1、P2、P4和P5蛋白存在于沉淀中。纯化的目的蛋白均以VLPs形式存在,免疫小鼠可有效激发OX40特异的抗体应答。结论成功构建并纯化制备了呈递OX40抗原表位的重组VLPs。

零信任技术在5G远程智慧医疗中的应用

随着5G、云计算等新技术的不断发展,医疗领域正在由信息化逐步向智慧化转型。然而,智慧医疗也带来了一系列的安全问题。如远程医疗安全边界越来越难以界定,重要医疗资产暴露风险、缺乏有效的安全准入手段等安全威胁等。本文通过对远程医疗趋于移动化的背景,以实现远程医疗安全接入为目标,通过应用安全准入控制、身份认证管理技术(IAM)、动态防火墙技术等技术,系统性地将5G与零信任安全合并思考,提出5G+零信任的安全模式,有效增强5G在远程医疗中的安全访问环境。