鼠伤寒沙门菌转录调控因子HilD的蛋白纯化及与hilA启动子DNA复合物晶体培养

目的本研究将获取鼠伤寒沙门菌毒力转录调控因子HilD的蛋白,培养HilD蛋白晶体,为进一步分析HilD功能机制和靶向胞内沙门菌药物研发奠定基础。方法以鼠伤寒沙门菌转录调控因子HilD生物信息学分析为基础,使用鼠伤寒沙门菌14028S菌株作为模板进行分子克隆,构建hilD-pGl01重组质粒,使用原核体系表达HilD,通过镍柱亲和层析柱和透析获取纯化蛋白。EMSA实验验证HilD活性。使用晶体培养试剂盒进行晶体培养。结果成功构建了HilD原核表达系统,HilD是一种碱性蛋白,在蛋白提取过程中需要将缓冲液的pH值维持在7.0左右以维持HilD蛋白的稳定性,还需添加2%甘油和2%蔗糖进行保护。hilA能够稳定HilD蛋白,有利于晶体的生长。结论成功获取HilD纯化蛋白,实验证明具有生物活性,培养出HilD与hilA启动子DNA的复合物晶体,复合物的培养为HilD结构解析奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC核心结构域及其激酶活性研究

目的鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC是沙门菌Ⅲ型分泌系统分泌的具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白,在蛋白磷酸化修饰中发挥重要作用。然而关于SteC催化磷酸化的机制尚不清楚。本研究通过分析SteC核心结构域的组成并构建原核表达体系,了解表达蛋白的性状并进行酶活性测定,为揭示SteC作为沙门菌激酶催化磷酸化的机制奠定基础。方法以生物信息学分析和液相色谱-质谱(LC-MS)联用分析技术为基础,通过基因克隆技术构建SteC蛋白原核表达体系,表达目的蛋白,使用Ni^(2+)亲和层析柱纯化SteC全长蛋白SteC-fl及C端蛋白SteC-C。采用蛋白酶裂解法,用不同浓度的胰蛋白酶对纯化的SteC-C蛋白进行酶切,选择稳定表达的区域进行LC-MS及DNAstar软件肽段序列鉴定及比对,确定SteC蛋白的核心结构域,进而构建核心结构域原核表达体系,探究蛋白的性状。使用Phos-tagSDSPAGE胶对SteC核心结构域蛋白进行酶活性验证,以确定SteC的核心区域是否具有活性。结果成功构建SteC-fl、SteC-C原核表达体系并获得目的蛋白,但SteC-fl蛋白得率低,因而选择SteC-C利用蛋白酶裂解法确定SteC稳定表达的区域。利用LM-MS方法及DNAstar软件分析SteC核心结构域(即227aa-305aa)并成功构建SteC_(227-305)原核表达体系。表达的SteC_(227-305)蛋白经Ni 2+亲和层析纯化后进行分析,其稳定性高于SteC-fl、SteC-C端,但可溶性差;使用Phostag复合胶对SteC_(227-305)蛋白进行酶活性验证,显示此结构域具有较弱的自磷酸化功能。结论成功构建鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC不同区域的原核表达体系(SteC-fl、SteC-C、SteC_(227-305))。利用LM-MS确定SteC核心结构域为227aa305aa,生物信息学分析显示SteC_(227-305)含有PKc_like保守结构域,稳定系数为29.23,即为稳定蛋白。SteC_(227-305)经Ni 2+亲和层析纯后其可溶性差而稳定性符合预期;Phos-tag复合胶验证其具有较弱的自磷酸化功能,为研究SteC蛋白催化磷酸盐转移的机制奠定了基础。