抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因 (aroAM12 )和人工合成重组Bt抗虫基因 (Bts1m)的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因的表达由 2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导 ,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中 ,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southernblot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因 ,约 70 %的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Immunodotblot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达 ,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明 。

根癌农杆菌介导的转aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性

以中棉35无菌苗下胚轴为外植体,采用农杆菌介导法将含有通过基因优化技术获得的草甘膦抗性突变基因aroAM12导入棉花中。以aroAM12为选择标记,利用草甘膦直接筛选获得65棵再生植株。PCR和Southernblot分析表明,经过草甘膦筛选出的T0代植株均整合有aroAM12基因。Western blot分析表明整合进的aroAM12基因得到了有效表达,且不同植株之间的表达不尽相同。大棚喷洒的实验结果表明T0代转化植株具有很高的草甘膦抗性。对T1代棉花的草甘膦抗性遗传分析表明,aroAM12基因以盂德尔方式遗传。

鱼类DNA制备方法的优化

分别用EDTA/SDS裂解、酚 /氯仿抽提法和CTAB法 ,对泥鳅的血液、肌肉等组织的DNA进行提取 。

抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株

构建了一种新的植物高效表达载体pAM12 s1m ,其上携带有通过基因优化 (geneshuffling)技术获得的抗草甘膦突变基因 (aroAM12 )和抗虫人工合成重组Bt基因 (Bts1m)。aroAM12基因表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因表达由2E 35S启动子和Ω因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为外植体 ,采用农杆菌介导法将aroAM12和Bts1m基因导入棉花品种石远 32 1中 ,以aroAM12基因作为选择标记 ,草甘膦为选择剂直接筛选获得 5 2棵再生植株。PCR和Southernblot分析表明再生植株均整合有aroAM12基因 ,其中 38棵植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Westernblot分析进一步证明整合到植株中的两个基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。离体叶片草甘膦抗性和虫试实验证明 ,获得的转基因棉花对草甘膦和棉铃虫具有较强的抗性。

泡桐属七种植物的RAPD分析

利用 1 3个 1 0 mer的随机引物对中国泡桐属的 7个种进行了 RAPD分析 ,对扩增形成的谱带进行了对比 ,发现 7个种间存在较丰富的多态性带纹。经用 UPGMA法聚类结果说明可把研究的 7个种分成 2个类群。其中白花泡桐与川泡桐亲缘关系最近 ,二者与揪叶泡桐、南方泡桐、山明泡桐归为 1个类群。毛泡桐与兰考泡桐亲缘关系也较近 ,二者在系统演化上比较原始 ,归为 1个类群。

泡桐属植物花粉形态研究

本文应用光学显微镜及扫描电镜对泡桐属五种植物花粉的形态进行了观察，结果表明，该属植物花粉为中等大小，近球形均具三孔沟，表面纹饰为网状．５ 个种之间在花粉大小，网状纹饰，内孔明显与否存在差异，说明花粉的一些形态特征指标可以作为泡桐属植物种之间分类的重要依据．

泥鳅和大鳞副泥鳅酯酶同工酶的比较研究

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析了泥鳅和大鳞副泥鳅的性腺、脑、肾、肝和心脏五种组织的酯酶同工酶。结果表明 :在不同器官中酯酶同工酶存在明显的组织特异性 ;比较泥鳅和大鳞副泥鳅酯酶同工酶它们的酶谱相似外 ,在它们的各个相应组织之间也显示出差异 ,表明酯酶同工酶在泥鳅种内具有一定的差异。这对于探讨泥鳅不同种之间的亲缘关系将是一个很有用的手段。

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GIII)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GIII)启动子(PGIII)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻。PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGIII-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中。GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达。T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGIII活性。这些结果表明PGIII是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子。

宫颈癌患者HPV16型L1基因克隆及序列分析

目的了解萍乡地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈脱落上皮细胞中提取DNA,进行PCR扩增鉴定,将扩增的片段同T-载体连接,然后导入到大肠杆菌DH-5α中培养,提取质粒DNA进行测序。结果测定的序列与标准基因序列（NC Sbjct 496）比较,萍乡地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为98.9%~99.6%,分别形成5种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但有1处由于核苷酸的丢失造成翻译的氨基酸也相应发生变化。结论萍乡地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异,可能会造成HPV16 L1蛋白免疫原性的差异。.此株改变也可能是本地区导致宫颈癌的主要原因。实验结果为研制适应本地区的基于HPV16 L1的基因工程疫苗提供了可靠实验依据。

液基细胞学检测及巴氏涂片在宫颈癌筛查中的应用比较

目的:比较潮州农村地区宫颈癌筛查中液基细胞学检测(TCT)和巴氏涂片检测的应用价值。方法:采用分阶段整群抽样方法,选取潮州市5个乡镇,招募35～59岁的女性,同时行人乳头状瘤病毒(HPV)检测、TCT和巴氏涂片检测,符合条件者进行阴道镜下活检和随访,评价TCT和巴氏涂片检测的筛查效果。结果:3723例接受筛查女性中,总体而言,TCT检测的灵敏度高于巴氏涂片(Fisher′s Exact Test,P<0.01),特异度、阳性预测值、阴性预测值无明显差异。两种检测方法的结果具有一致性(Kappa=0.14,P<0.001)。巴氏涂片制片不满意率高于TCT(χ2=64.3,P<0.001)。结论:此次农村地区宫颈癌筛查中,相比巴氏涂片检测,TCT更为灵敏、制片效果更好,能提高宫颈病变的检出率,但诊断准确性没有明显差异。

粤东地区妇女人乳头瘤病毒的筛查与分析

目的分析粤东地区宫颈组织中人乳头瘤病毒(human papilma virus,HPV)的流行状况和感染亚型分布,以及宫颈癌中各亚型的比例,为粤东地区宫颈癌致癌机制及HPV疫苗研制提供理论支持。方法采用凯普的基因芯片导流杂交HPV DNA检测法,对2122例粤东地区妇女宫颈样本进行21种HPV亚型的检测与分析,并最终行阴道镜下组织病理学活检确定宫颈癌例数。结果 2122例受检者HPV阳性例数为523例,总阳性率为24.6%;HPV各亚型在HPV阳性中出现的频率较高依次为:HPV16(30.6%)、HPV52(22.2%)、HPV58(15.1%)、HPV6(10.7%)、HPV CP8304(7.5%)、HPV18(7.3%)、HPV53(7.3%)、HPV11(7.1%)、HPV31(6.3%)等。其中发现宫颈癌39例。结论粤东地区妇女HPV有较高的感染率,高危型感染的主要型别是HPV16、HPV52、HPV58,其中宫颈癌中主要感染亚型为HPV16、HPV18和HPV52。

两种宫颈癌细胞学筛查方法的横断面比较

目的对子宫颈癌和癌前病变的两种细胞学筛查方法进行分析比较与评价。方法 2010年3—7月在广东省潮州市农村地区开展以35～59岁女性人群为基础的宫颈癌筛查横断面研究,包括液基细胞学检测(TCT)、巴氏涂片和高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)检测。HR-HPV阳性者进行HPV分型检测。对细胞学诊断>未明确意义的不典型鳞状上皮细胞(ASC-US)及细胞学诊断为ASC-US合并高危HPV阳性者行阴道镜下宫颈组织活检。结果 TCT和巴氏涂片筛查的阳性率(≥ASC-US)分别为5.6%和3.6%,差异有统计学意义。以组织学病理诊断≥CINⅡ为病理学阳性,细胞学筛查≥ASC-US为阳性,TCT和巴氏涂片筛查的灵敏度分别为86.1%和22.2%,阳性预测值分别为14.9%和5.9%。结论 TCT筛查阳性率高于巴氏涂片,在灵敏度及阳性预测值方面优于巴氏涂片。

广东省潮州地区农村妇女对宫颈癌筛查的认知及影响因素调查

目的了解广东省潮州地区农村妇女对宫颈癌筛查的认知程度，为开展宫颈癌筛查及健康教育工作提供依据。方法对广东省潮州地区35—59岁农村妇女进行问卷调查，一对一问答式填写，分析不同年龄段、文化程度、家庭收入妇女对宫颈癌筛查的认知情况。结果知道宫颈癌能早期发现并治疗者有7人（0．055％），知道宫颈癌的筛查方法者有28人（0．22％），知道人乳头状瘤病毒（以下称HPV）者有111人（0．88％），知道宫颈癌者共有722人（5．7％），所有参与调查的妇女（12660人）均未定期进行宫颈癌筛查，仅有2人知道HPV是宫颈癌的危险因素。结论广东省潮州地区农村妇女对宫颈癌筛查的认知极度缺乏，需多方位着手，进行多渠道、多形式的健康普及教育。

广东省宫颈癌防治工程项目关键技术创新及实践成效

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,发病率和致死率居高不下,对妇女健康造成很大威胁.《中国妇女发展纲要(2011—2020年)》中宫颈癌防治是妇女健康重要的目标之一,国家"十二五""十三五"规划中把宫颈癌防治纳入我国"两癌"防治的重大项目之一.为提升广东省宫颈癌防治的科学水平、科技研发和技术创新能力,实现科技转化应用实践,造福广大妇女同志,省政府高度重视,组建由广东省妇幼保健院为组长单位,联合高等院校、医疗机构、科研机构、高新技术企业及妇幼保健机构组成的攻关团队,成立"广东省宫颈癌防控中心",构建宫颈癌防治科技创新平台和防治网络体系,通过全省大规模实践,推进广东省宫颈癌防治水平上新台阶.

广东省潮州地区农村妇女宫颈癌不同筛查方法的效果评价

目的探讨对广东省潮州地区农村妇女采用高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染、液基细胞学(LBC)和传统巴氏涂片(CPS)筛查法进行宫颈癌筛查的效果,为建立适宜农村地区妇女的宫颈癌筛查策略提供依据。方法选择2011年3月至6月,采用分阶段整群抽样法在潮州地区5个乡镇招募的3723例35～59岁符合筛查条件的农村常住妇女为研究对象(子宫颈完整存在)。对其同时采用高危型HPV,LBC和CPS筛查法进行宫颈癌筛查,并对其中HPV呈阳性者进行HPV分型。对宫颈细胞学改变为低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、HPV呈阳性的未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASC-US)、非典型鳞状细胞、不能排除高级别鳞状上皮内病变(ASC-H)的受试者,进行阴道镜下宫颈组织活检及随访,评价不同筛查法的筛查效果(本研究遵循的程序符合广东省妇幼保健院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,并与受试者签署临床研究知情同意书)。结果 3723例接受宫颈癌筛查的受试者中,高危型HPV感染率为8.2%,常见HPV亚型为HPV-52,-16,-58,-33及-68;宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ～Ⅲ检出率分别为1.05%(39/3723),0.40%(15/3723)和0.54%(20/3723)。若以宫颈组织病理学活检结果≥CINⅡ为标准,则高危型HPV,LBC和CPS筛查法的灵敏度与特异度分别为94.4%(34/36)与46.6%(27/58),97.2%(35/36)与25.9%(15/58)及52.9%(9/17)与38.0%(19/50)。3种宫颈癌筛查方法的灵敏度与特异度比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。LBC与CPS对宫颈癌筛查的阳性预测值(PPV)分别为44.9%(35/78)与22.5%(9/40),且差异具有统计学意义(χ2=5.7,P=0.02)。结论在广东省潮州地区农村妇女中开展宫颈癌筛查发现,高危型HPV检测法相对于LBC,具有更高灵敏度和特异度,在成本许可条件下具有一定推广价值;而LBC相对于CPS,具有更高灵敏度、PPV和更好的制片效果。

人乳头瘤病毒分型检测在宫颈癌前病变和宫颈癌筛查中的应用价值

目的评价凯普人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒用于高危型HPV-DNA分型检测在宫颈癌前病变早期筛查中的应用价值。方法以2017年6-7月在广东、山西、河南三省招募的9914例(河南省3233例,山西省3301例,广东省3380例)宫颈癌筛查对象作为研究对象,所有研究对象均进行HPV-DNA检测,HPV阳性且细胞学检查结果≥意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)、HPV阴性且细胞学检查结果≥不典型腺细胞(LSIL)的受试者进行阴道镜检查和活检。以病理学诊断作为金标准,计算高危型HPV和HPV16/18检测的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及其95%CI。结果9914例筛查对象的年龄为(45.0±9.3)岁。其中高危型HPV阳性者1302例,HPV16阳性者211例,HPV18阳性者64例。以病理检测结果宫颈上皮内瘤变2级及以上(CIN2+)为金标准,HPV-DNA检测对ASCUS人群的分流效果为高危型HPV型别的灵敏度为90.6%(95%CI为75.8%~96.8%),特异度为78.0%(95%CI为74.5%~81.2%);HPV16/18型别合并检测的灵敏度为56.3%(95%CI为39.3%~71.8%),特异度为95.7%(95%CI为93.8%~97.1%)。HPV-DNA检测对总人群宫颈癌前病变筛查效果为高危型HPV型别的灵敏度为95.1%(95%CI为88.1%~98.1%),特异度为87.6%(95%CI为86.9%~88.2%);HPV16/18型别合并检测的灵敏度为65.9%(95%CI为55.1%~75.2%),特异度为97.8%(95%CI为97.5%~98.1%)。结论凯普HPV检测试剂盒对宫颈癌前病变筛查和ASCUS人群分流具有较高的灵敏度和特异度,是有效的HPV-DNA检测方法,可用于人群中宫颈癌前病变和宫颈癌的筛查。

华南人群地中海贫血的罕见基因突变

目的探讨华南地区地中海贫血（简称地贫）的罕见基因突变类型。方法对来自华南地区13个不同地理区域的327例因血液学表型与常见基因突变检测结果不符、疑似为罕见地贫的样本，应用跨越断裂点聚合酶链反应（GAP-PCR）和DNA测序进行鉴定。结果共检出地贫罕见基因突变108例，其中包含10种罕见的a珠蛋白基因突变，分别为泰国型缺失（-THAI）、香港型缺失（HKα）、aaaanti3．7、ddaanti4．2、-α2．8、-α27．6、CD74GAC〉CAC（Hb Q-Thailand）、CD30（-GAG）、CD31 AGG〉AAG和CD118（＋TCA），12种罕见B珠蛋白基因突变，分别为CD37 TGG〉TAG、CD39 CAG〉TA6／CD39 CAG〉TAG、βII-2（-T）、-90（C〉T）、-31（A〉C）、-88（C〉T）、CD7（-A）、CD138（＋T）、CD89-93（-AGTGAGCTGCACTG）、CD54—58（-TATGGGCAACCCT）、中国型Gγ＋（Aγδβ）0和越南型HPFH（Vietnamese HPFH，HPFH-6）缺失。其中β珠蛋白基因-88（C〉T）（HBB．c．-138C〉T）和CD39 CAG〉TAG（HBB．c.118C〉T）突变在中国人群中尚未见报道，CD7（-A）（HBB：c．23delA）和CD138（＋T）（HBB：c.416_417insT）为新发现的基因突变类型。结论本研究的结果充实了华南地区地贫基因突变的类型，可为地贫的诊断提供必要的分子信息。