牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

实验旨在建立牛重组IFN-γ（BovIFN-γ）的ELISA检测技术，为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞，从培养细胞中提取总RNA，经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA，进一步克隆至pET28a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导，表达出预期大小（18kD左右）组氨酸标记蛋白，经鉴定为BovIFN-γ；以纯化的重组BovIFN-γ为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10、G6与G10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1，腹水效价在1：2^10×100～1：2^11×100之间。Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ。ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应，而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应。选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗免IgG，建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。实验结果表明，此方法检测敏感性达到2ng／mL，特异性良好，为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。

禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用

根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18_T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX_KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS_PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD ,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条。在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景。

间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用

针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。

牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用

为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,热稳定性好,用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期,检测70份临床奶牛血清,与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71.4%和88.6%的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合,为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法,。

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析

目的牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析。方法应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、cfp-10和esat-6四个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因cfp10-esat6和mpb83-cfp10-esat6,将mpb70和mpb83-cfp10-esat6串连于载体pUC19-Linker上,再将mpb70-mpb83-cfp10-esat6连于表达载体pET28a(+)中得到重组质粒pET70-83-C10-E6。转化BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。用Ni2+亲合层析法纯化该融合蛋白。结果经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应,说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛其它疾病的阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白属于热稳定性蛋白。结论融合表达了牛分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白,该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。

我国亟待加强奶牛重大疫病预警体系建设

我国奶牛业近年来的飞速发展给奶牛疫病防治带来巨大压力。虽然我国已初步建成了动物疫病的监测与预警系统,但尚不能满足疫情的实时测报和预警的实际需求。需要从支撑技术、网络建设、信息系统等各方面加强我国奶牛重大疫病的检测与预警体系建设,以保证奶业可持续发展和人民健康。

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和初步运用

目的:建立一种快速检测牛结核抗体的新方法,用以诊断牛结核病。方法:利用胶体金免疫层析技术原理,用大肠杆菌表达的牛分枝杆菌重组抗原MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果:粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为6.0;MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg;MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL;交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条。在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆茵分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。结论:快速检测牛结核抗体的胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核根除计划中具有良好的应用前景。

家猫ACE2基因克隆、测序及生物信息学分析

本研究从家猫组织中扩增并鉴定血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因,为阐明SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)感染家猫的机制提供理论依据.从家猫肺脏中提取总RNA,以Oligo dT-Adaptor为引物合成第一链cDNA,根据人及小鼠的ACE2基因mRNA序列设计系列引物,通过聚合酶链式反应,分段扩增出家猫ACE2基因的编码区的特异性片段并测序鉴定.家猫ACE2基因mRNA编码区共包括2 418个核苷酸,推测编码蛋白含805个氨基酸残基.其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠ACE2氨基酸序列的同源性分别达到85%,81%和81%.利用多种生物信息学工具软件对家猫ACE2蛋白的理化及生物学性质进行分析.比较人、家猫、果子狸、小鼠、大鼠等ACE2序列中与SARS-CoV结合有关的3个功能区,发现家猫ACE2与人ACE2的同源性最高,提示家猫ACE2在SARS病毒跨种感染中可能发挥重要作用.

SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的表达及免疫原性分析

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

基于文献分析的食管癌精准治疗研究

目的探寻食管癌精准治疗的研究进展和未来的发展方向,为患者的个体化治疗或精准治疗临床研究提供参考信息。方法检索万方医学网和科学引文索引(SCI)网络版数据库中关于食管癌精准医学相关文献,并从文献的年发文量、发表期刊、发文机构、国家和地区、学科分布和关键词频率等对检索结果进行计量分析。结果共检索到中文文献6 869篇,英文文献7 773篇。近10年中文文献总体呈逐年下降趋势,而英文文献正好相反,且英文文献中发文量最大的国家为中国(4 136篇,53.2%),远超过排名其次的美国(1 657篇,21.3%)和日本(835篇,10.7%);在中外文献中高发文机构均为中国高校,分别以河北医科大学第四医院(中文文献187篇,20.0%)和郑州大学(英文文献442篇,5.7%)为首;中英文文献内容均以肿瘤学为主,分别为5 082篇(83.0%)和3 946篇(50.8%)。研究热点主要是食管鳞状细胞癌的发病机制、诊断标志物和预后改善。结论近10年食管癌的研究主要偏向于早期癌变基因及其致癌作用机制探索的基础研究,根据食管癌患者的基因型、表型、环境和生活方式等各方面因素的异质性从而制定出个性化诊断和治疗措施,是临床研究的关注重点。

中链化学品微生物制造

中链脂肪酸(C_(6)-C_(12))衍生的化学品包括脂肪醇、脂肪烃、中链酯、ω-修饰脂肪酸等,这些化合物是生物燃料、聚合物、日用化学品、特种化学品的重要组分。天然微生物底盘不能合成中链脂肪酸,而通过操纵脂肪酸合成、逆β-氧化等碳链延伸途径,尤其是表达生成游离中链脂肪酸的硫酯酶,可使大肠埃希菌、酿酒酵母等微生物细胞合成超过1 g/L的中链脂肪酸。引入脂肪酸衍生反应,如羧基还原、脱羧、ω-氧化等,可合成许多中链化学品。本文综述了中链化学品合成的酶学基础以及代谢工程策略,为中链化学品高效生物制造提供参考和思路。

体外抑制鸡传染性支气管炎病毒的多肽鉴定

使用纯化的鸡传染性支气管炎病毒(IBV),从12肽噬菌体随机展示肽库中筛选特异性结合多肽．经过四轮淘筛,得到10个阳性噬菌体,进一步进行测序、血凝抑制活性及病毒抑制特性鉴定．所有阳性噬菌体均能特异性阻断IBV对HeLa细胞的感染,并能抑制IBV对鸡红细胞的血凝活性．人工合成其中一条病毒抑制效价最高的线性多肽“GSH HRH VHS PFV”,其细胞抑制试验证实该多肽同样具有病毒抑制特性．以上结果为研制抗病毒分子及鉴定病毒与细胞相互作用功能域等奠定了基础．

北红尾鸲的鸟巢行为观察

北红尾鸲的鸟巢行为观察张晏，谭亚娣（清化大学生物系９１级北京１０００８４）北红尾鸲Ｐｈｏｅｎｉｃｕｒｕｓａｕｒｏｃｕｓａｕｒｏｒｅｕｓ（Ｐａｌｌａｓ）属雀形目，鸫科，红尾鸲属，英文名为ＤａｕｒｉａｎＲｅｄｓｔａｒｔ。１９９３年６月２７日至７月５日我们...