空斑试验在微生物实验教学中的改进及应用

目的通过更换侵染病毒来改进制作“空斑试验”示教板,以得到更鲜明的“空斑试验”结果,使其更好地服务本科实验教学。方法用不同滴度的寨卡病毒和登革病毒感染培养于12孔细胞培养板的Vero细胞,置37℃吸附2 h。吸附后,用1%甲基纤维素Eagle氏覆盖液进行覆盖步骤,置细胞于37℃培养6~7 d将细胞固定和染色后,用自来水冲洗,待干。结果感染寨卡病毒的未死亡脱落的Vero细胞被结晶紫染色,紫色背景明显。肉眼可看到寨卡病毒感染细胞产生的无色空斑,空斑呈圆形,清晰完整,边缘整齐。空斑数量随着病毒浓度的升高而增加,复孔产生空斑数量趋势一致。感染登革病毒的未脱落Vero细胞被染成紫色,形成较鲜明的紫色背景,登革病毒感染细胞产生了无色空斑,但是空斑的形成数量较少,且不是所有复孔都产生了空斑。随着病毒稀释倍数增加,产生的空斑数量无明显减少趋势。结论用寨卡病毒感染Vero细胞能得到更典型的空斑试验结果,该方法更适用于本科教学制作示教结果用。

PSM-E抑制炎性细胞因子分泌及单核细胞趋化的功能研究

目的探索在前列腺癌中前列腺特异性膜抗原(PSMA)的新型剪切变异体PSM-E对炎性细胞因子的分泌,及其对单核细胞趋化的影响。方法采用免疫组织化学染色法检测110例原发性前列腺癌组织中PSM-E与肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表面特异性蛋白CD206的表达。用siRNA转染LNCaP细胞干扰PSM-E的表达作为实验组,对LNCaP细胞转染对任何基因无干扰作用的siRNA作为对照组。利用佛波酯和白细胞介素-4(IL-4)刺激单核细胞THP-1诱导其分化为M2型TAMs。将M2型TAMs分别与实验组和对照组LNCaP细胞共培养72 h后,收集培养基上清,采用炎症因子芯片检测共培养系统中细胞因子的变化。将单核细胞系THP-1分别与实验组和对照组LNCaP细胞共培养72 h后,结晶紫染色观察单核细胞趋化情况。结果110例原发性前列腺癌组织中,PSM-E呈高表达的阳性率为54.5%(60/110),CD206呈高表达的阳性率为58.1%(64/110)。Spearman相关性分析结果显示,以免疫组化评分为指标,PSM-E与CD206表达呈负相关(r=-0.5,P<0.01)。成功构建PSM-E敲低的前列腺癌LNCaP细胞模型和M2型TAMs细胞模型(THP-1来源)。与阴性对照组相比,PSM-E敲低细胞组的PSM-E的mRNA水平表达量显著降低(P<0.05);与M0型巨噬细胞相比,M2型TAMs细胞标志物基因CCL17、CCL18、CCL22的表达显著增高(P<0.05)。与对照组相比,将敲低PSM-E的前列腺癌LNCaP细胞与TAMs共培养后,细胞培养上清中的干扰素γ诱导的T细胞α型趋化因子(ITAC)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Fractalkine、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-3α、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-4、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23炎性细胞因子均呈较强升高,提示PSM-E可抑制肿瘤微环境中炎症细胞因子的分泌。与对照组相比,将THP-1细胞与敲低PSM-E的前列腺癌LNCaP细胞共培养后,趋化的穿过培养小室的细胞数量显著增加。结论PSM-E具有抑制肿瘤微环境中炎性细胞因子的产生,进而抑制单核细胞趋化的新功能,提示PSM-E可成为肿瘤相关巨噬细胞靶向性治疗的一个新分子靶点。