岩白菜素对大鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤保护作用的机制研究

目的 探究岩白菜素(Ber)减轻大鼠心肌细胞(H9C2)缺氧/复氧损伤(SI/R)的分子机制。方法 建立H9C2缺氧/复氧损伤模型,通过免疫印迹法检测关键分子的表达,通过末端标记法染色和乳酸脱氢酶释放量检测细胞损伤,通过二氯荧光素染色及丙二醛(MDA)检测细胞内活性氧(ROS)水平,通过分别给予EX-527和SR-18292抑制沉默交配型信息调控2同源物1(SIRT1)和过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α(PGC-1α)。实验按干预方法不同分组,分别为Bey干预组(SI/R+Ber)、Bey+SIRT1抑制剂组(SI/R+Ber+EX-527)、对照组(SI/R+PBS)。SI/R+Ber组加入含有100μM的Ber培养基进行干预,SI/R+Ber+EX-527组加入含有100μM的Ber和50 nM EX-527的培养基进行干预。SI/R+PBS组为磷酸缓冲液(PBS)干预作为对照组。结果 与SI/R+PBS组相比,SI/R+Ber组Bcl-2的表达水平升高(P <0.001),Bax的表达水平显著降低(P <0.001),PGC-1α的表达水平明显升高(P <0.001);与SI/R+Ber组相比,SI/R+Ber+Ex-527组Bcl-2的表达水平降低(P <0.001),Bax的表达水平显著升高(P <0.001),PGC-1α的表达水平明显降低(P <0.001)。给予PGC-1α的抑制剂SR-18292后,与SI/R+Ber组相比,细胞活力显著降低(P <0.01);乳酸脱氢酶释放显著升高(P <0.001);MDA生成显著升高(P <0.01),大鼠心肌细胞的凋亡指数明显升高(P <0.01),ROS的产生明显升高(P <0.01),Bcl-2表达水平显著降低(P <0.001),Bax表达水平升高(P <0.01),SIRT1表达水平无明显变化(P> 0.05)。结论 Ber通过激活SIRT1/PGC-1α通路来减少ROS的产生,进而抑制SR/I损伤中的大鼠心肌细胞凋亡。

Asprosin的表达纯化及其对小鼠在体心脏功能的作用

目的利用大肠埃希菌原核表达并纯化asprosin蛋白,研究其对心功能改善的影响。方法从GenBank获取asprosin编码序列,根据大肠埃希菌密码子偏好性进行密码子优化,全基因合成,连接于表达载体,进行IPTG诱导表达并纯化。通过对冠脉左前降支结扎再放松,建立小鼠心功能损伤模型。将30只小鼠随机分成3组:假手术组(sham)、心功能损伤组(MI/R)和心功能损伤并注射重组蛋白组(MI/R+r Asp)。通过心动超声检测左室功能,对心功能损伤程度进行评价,进而研究Asprosin对心功能改善的影响。结果经过原核表达并纯化,目标蛋白纯度大于95%,内毒素含量小于<0.1 EU/μg蛋白,适于进行细胞及动物研究。成功建立了心功能损伤模型,与单纯损伤组相比,外源给予重组asprosin蛋白后,小鼠心脏心功能明显改善(P<0.05)。结论 Asprosin蛋白具有抑制心功能损伤,改善心功能的作用。

利用响应面法优化海洋微生物发酵产角鲨烯的研究

采用响应面法对海洋微生物Pseudozymasp.SD301发酵产角鲨烯培养条件进行优化。在单因素实验结果的基础上,通过Design-Expert软件对葡萄糖浓度、接种量、培养温度、装液量进行4因素响应面实验设计,以角鲨烯产量为响应值,优化菌株Pseudozymasp.SD301的培养条件,并验证响应面预测值与实测值的一致性。结果表明,在葡萄糖浓度为67.2g·L-1、接种量为1.5%、培养温度为26℃、装液量在41mL/250mL的最优培养条件下,角鲨烯产量为1.152g·L-1,比出发条件提高了3.62倍,实测值与响应面预测值吻合良好。

脂联素对流体切应力下骨髓间充质干细胞损伤的保护作用观察

目的探讨脂联素(APN)是否可减轻流体切应力(SS)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的损伤及其可能机制。方法采用全血贴壁法分离、培养BMSCs并进行鉴定。将BMSCs分为对照组、SS组、SS+APN组,采用平板液体流动腔模型给予BMSCs流体切应力作用24h,显微镜下观察细胞形态,TUNEL染色检测BMSCs的凋亡情况,Western blotting检测Akt、p-Akt及Bax蛋白的表达。结果与对照组比较,SS组BMSCs凋亡明显增加,Bax表达明显上调。与SS组比较,SS+APN组细胞形态明显改善,细胞增殖显著增加,Bax表达显著下调,p-Akt表达显著上调。三组Akt的表达无明显差异。结论脂联素可通过激活Akt信号通路抑制流体切应力对BMSCs的损伤。

GDF11对Ⅱ型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用

目的观察GDF11对Ⅱ型糖尿病C57BL/6J小鼠心肌损伤的保护作用及心肌凋亡水平的变化情况。方法 60只体重20~25 g的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为3个组:正常对照组(control)、II型糖尿病模型组(DM)和GDF11干预组(DM+GDF11)。高脂高糖饲料饲养4周后,连续3次腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素(STZ),建立II型糖尿病小鼠模型,持续高脂高糖饲料饲养4周后,小动物超声检测心功能,取心肌组织,TUNEL染色检测心肌组织凋亡比例,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果糖尿病损伤显著下调左室射血分数和左室短轴缩短率,增加心肌凋亡率,而给予重组GDF11蛋白能够明显改善心功能并减轻心肌凋亡。结论外源性的GDF11可以显著减轻糖尿病损伤后心肌凋亡水平,改善心功能。

利用伯克霍尔德氏菌脂肪酶富集裂壶藻油脂中的二十二碳六烯酸

目的:研究伯克霍尔德氏菌胞外脂肪酶对裂壶藻油脂中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的富集作用。方法:用三丁酸甘油酯平板筛选法,筛选产脂肪酶的细菌;以对硝基苯月桂酸酯为底物,对筛选得到的伯克霍尔德氏菌脂肪酶的酶学性质进行研究;用该脂肪酶水解裂壶藻油脂,通过气相色谱法测定酶解后水相和有机相的脂肪酸组成来研究其对裂壶藻油脂DHA的富集作用。结果:从广州的泥土样品中分离获得一株高产胞外脂肪酶的伯克霍尔德氏菌,在产酶培养基中30℃、200 r/min的条件下培养40 h后,脂肪酶酶活力达到最大值70 U/m L。脂肪酶粗酶液酶活性的最适温度为45℃,最适p H值为8.5。该菌的脂肪酶对裂壶藻油脂中的DHA有一定的富集作用,能够使油脂中DHA占总脂肪酸的质量分数从最初的30%升高到40%。结论:筛选得到一株能够产生选择性富集DHA的脂肪酶的细菌,拓宽了可用于多不饱和脂肪酸分离纯化的脂肪酶的范围。

简易灌注装置同时提取成年小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞

目的简化Langendorff灌注装置,并且同时提取成年小鼠心肌细胞(AMCM)和心脏成纤维细胞(AMCF)用于实验。方法采用简易灌注装置进行成年小鼠主动脉逆行灌注,同时提取AMCM和AMCF。对其进行形态学观察,并分别通过L-苯肾上腺素(PE)和转化生长因子(TGF)-β1刺激诱导AMCM肥厚和AMCF向肌成纤维细胞分化,以评估其生物学功能。结果复钙后耐钙杆状AMCM占比(62.65±3.12)%,并且可以在体外培养超过1周,与对照组相比,PE刺激后AMCMβ-肌球蛋白重链、心钠肽蛋白表达水平显著升高(P<0.05),杆状AMCM长宽比显著缩小(P<0.05)。AMCF纯度较高,在体外可以传代3~4次,与对照组相比,TGF-β1刺激后AMCF Collagen I、Collagen III、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)和荧光强度显著增强(P<0.05)。结论简易灌注装置可以简单、稳定、高效地同时提取满足实验需求、具备生物学功能的AMCM和AMCF。

CTRP9抑制低氧环境下肺微血管内皮细胞IL-6和TNF-α表达的研究

目的研究低氧环境下C1q肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/TNF-related protein 9,CTRP9)对肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)中白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为常氧组、低氧组,采用低压低氧法建立大鼠低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)模型,28 d后检测各组大鼠血流动力学、右心室肥厚指标和组织病理学改变;用RT-PCR检测HPH大鼠肺组织中IL-6、TNF-αmRNA表达水平;用ELISA法检测二者在血清中的变化。分离培养健康雄性SD大鼠的PMVEC,分别在常氧(210 ml/L O_2、50 ml/L CO_2)、低氧(50 ml/L O_2、50 ml/L CO_2)、或者低氧+CTRP9(5μg/ml)环境中孵育48 h。结果与常氧组相比,低氧组大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指标增加(P<0.05),肺小动脉管壁增厚,显示造模成功;肺组织中IL-6、TNF-αmRNA水平上调(P<0.05),两种炎症因子在血清中的含量增加(P<0.05)。与常氧组相比,低氧处理使两种炎症因子IL-6、TNF-α在PMVEC中mRNA水平及在细胞培养上清中的含量均增加(P<0.05);在低氧的同时给予CTRP9孵育时,与单纯低氧组相比,两种炎症因子在PMVEC中mRNA水平及在细胞培养上清中的含量均降低(P<0.05)。结论大鼠发生HPH时,炎症因子IL-6、TNF-α表达升高。而CTRP9对低氧条件下PMVEC表达和分泌IL-6及TNF-α具有抑制作用,进而有望预防或延缓HPH的发生发展。

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L-缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicumATCC13032中克隆出L-缬氨酸合成途径上的限速酶——乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B.flavumATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐发酵实验结果显示:在野生型菌株发酵液中检测不到L-缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L-缬氨酸积累达5.0g/L。

脂肪因子在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

1 心肌缺血再灌注损伤概述 缺血性心脏病发病率和死亡率高,是全世界患者的主要死亡原因。目前,药物溶栓、介入、冠状动脉旁路移植术等血管再通和心脏辅助技术是治疗缺血性心脏病的有效手段,再通技术使缺血区域动脉血流重新恢复的同时也使心肌组织面临"二次打击",表现为心肌细胞坏死、组织结构紊乱和器官功能损害进一步加重,即心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MI/R)[1]损伤。

CTRP9对心血管保护作用的研究进展

补体1q肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP)9是CTRP蛋白家族重要成员,与脂联素高度同源,结构相似。近几年发现CTRP9在动脉粥样硬化、缺血性心脏病(IHD)等心血管疾病中作用广泛。除了经典的调节糖脂代谢、调节内皮功能外,最近的研究显示外源性补充CTRP9能够对缺血心肌发挥保护作用,而且CTRP9在心脏局部特异性高表达,可能是一种重要的心脏因子,参与调节心肌局部微环境,发挥心肌保护作用,本文将就CTRP9在心血管保护方面的研究进展进行综述。

沉默信息调控因子1通路介导补骨脂酚抑制脂多糖诱导的乳鼠心肌细胞炎症反应及凋亡

目的研究补骨脂酚(BAK)对脂多糖(LPS)诱导的SD乳鼠心肌细胞炎症反应模型的作用及其分子机制。方法SD乳鼠心肌细胞经1μM、5μM或10μM的BAK孵育4 h后,再用LPS(100 ng/ml)孵育12 h,造成炎性心肌细胞损伤。用CCK8法检测心肌细胞活力,TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。ELISA法检测培养基中炎性因子TNF-α和IL-1水平,Western-blot法检测SIRT1、Bax和Bcl-2的表达水平。使用沉默信息调控因子1(SIRT1)阻断剂EX527观察SIRT1信号通路在这一过程中的作用。结果 LPS处理可以诱导心肌细胞炎性因子肿瘤坏死因子-α和白介素-1释放(P<0.05 vs control组),降低心肌细胞活力并促进其凋亡。蛋白水平抑制SIRT1表达,Bcl2下调,Bax上调(P<0.05 vs control组)。1μM、5μM和10μM的BAK预孵育可浓度依赖性地抑制炎性因子释放、改善心肌细胞活力、上调SIRT1表达,提高Bcl2并降低Bax表达,抑制心肌细胞凋亡。SIRT1阻断剂EX527可显著抑制上述抗炎及抗凋亡作用。结论 BAK通过激活SIRT1信号通路,减轻LPS诱导的大鼠心肌细胞炎症反应。

血清补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3水平与慢性心力衰竭的相关性分析

目的探讨血清补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)浓度水平与瓣膜性心脏病(VHD)和扩张型心肌病(DCM)所合并的心力衰竭的相关性。方法选取的病例是由2016年11月至2017年1月本院收治的59例VHD和DCM导致的心力衰竭患者,患者心功能均为美国纽约心脏病协会(NYHA)分级Ⅱ～Ⅳ级,另选取50例同期来院的健康体检者作为健康对照组。收集两组患者一般临床资料,采用酶联免疫吸附法测定入院时采集的患者血清中CTRP3的浓度,进行统计学分析比较两组CTRP3的水平,并比较不同NYHA分级、不同病因所导致的心力衰竭患者的血清CTRP3水平,分析血清CTRP3水平与血清N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)浓度和左室射血分数(LVEF)值的相关性。结果病例组患者血清CTRP3浓度较对照组显著升高,且NYHA心功能分级等级越高,血清CTRP3浓度越高,差异有统计学意义(P <0.05)。心衰患者血清CTRP3水平与血清NT-proBNP水平呈线性正相关,与LVEF值呈线性负相关,有统计学意义(P <0. 05)。DCM患者血清CTRP3水平较VHD患者高,差异有统计学意义(P <0.05)。结论慢性心力衰竭患者血清CTRP3水平显著升高,且随心衰程度加重而升高,不同病因导致的心衰血清CTRP3升高程度也存在差异。

原代SD仔鼠心肌成纤维细胞分离与培养方法的改进

目的探索更好的原代心肌成纤维细胞分离与培养的方法。方法将取出的10只SD仔鼠心室组织置入预冷的PBS中修剪、冲洗后移入无菌玻璃瓶中剪碎;应用胰酶消化液进行初步消化;应用磁力搅拌器搅拌代替滴管吹打混匀Ⅱ型胶原酶消化液与心肌组织块促进消化顺利进行;应用差速贴壁方法分离成纤维细胞与心肌细胞;应用倒置显微镜观察细胞形态均一性、免疫荧光染色检测Vimentin及CD31表达鉴定心肌成纤维细胞纯度;检测心肌成纤维细胞对TGF-β_(1)诱导的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化评估分离的心肌成纤维细胞质量。结果磁力搅拌器搅拌混匀胶原酶消化液与心肌组织块的方法引起的细胞损伤小,消化充分,分离细胞纯度高(Vimentin+/CD-31-,P2代成纤维细胞纯度可达95%以上),细胞活力好,贴壁时间短(约20 min已开始贴壁,90 min贴壁完全),分离所的心肌成纤维细胞激活程度低(α-SMA表达水平低),对TGF-β_(1)诱导刺激反应好(α-SMA表达水平急剧升高)。结论磁力搅拌器方法可成功分离建立高质量的心肌成纤维细胞系。

充分发挥专职科研人员在临床实验室中的重要作用

临床实验室专职科研人员在科研工作的延续性、实验技术的传承性及实验室质控的稳定性等方面发挥重要的作用。明确职责,分工合作,充分调动实验室专职科研人员在临床实验室中的积极性,在确保高质量完成各项科研任务、培养高素质创新人才、提升科室整体实力方面具有重要的作用。

C1q/TNF相关蛋白3减轻氧化应激诱导的间充质干细胞衰老

目的建立间充质干细胞(MSCs)衰老模型,探讨C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)对衰老MSCs的作用并初步探讨机制。方法用过氧化氢(H_2O_2)诱导小鼠MSCs衰老,CCK8实验和β-半乳糖苷酶染色验证模型的建立。外源性给予CTRP3处理MSCs 24 h,CCK8实验检测增殖活性,β-半乳糖苷酶染色检测MSCs衰老,分化诱导实验检测MSCs分化能力,Western blotting法检测MSCs凋亡。RT-PCR检测MSCs中衰老相关基因P16、P21以及抗衰老基因SIRT1的mRNA表达变化。采用GraphPad Prism 6进行统计分析。组间比较采用方差分析或LSD两两比较。结果 H_2O_2可抑制MSCs的增殖活性,且呈浓度依赖性。与正常对照组相比,200μmol/L H_2O_2作用4 h,细胞立体感消失,细胞形态不规则;CCK8染色结果显示细胞增殖活性显著下降;β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高。继续CTRP3处理24 h后,衰老MSCs增殖和分化能力增强。Western blotting结果表明CTRP3可显著减低衰老MSCs的凋亡。RT-PCR检测发现CTRP3上调MSCs抗衰老基因SIRT1 mRNA表达,并且下调衰老相关基因P16、P21 mRNA的表达。结论 CTRP3可抑制MSCs衰老,SIRT1基因表达水平上调,及P16、P21基因表达水平下调可能是其重要机制。

关于心血管外科医学本科生科研创新能力培养的思考

目前,医学教育中提倡发展研究型医科大学,培养高素质创新型人才的关键是需要培养具有较强科研创新思维和能力的人才。为提高医学本科生自主创新精神和创新能力,空军军医大学第一附属医院(西京医院)心血管外科进行了医学本科生科研创新能力培养教学改革探索。从某一常见临床心血管疾病出发,学生通过自主查阅文献,提出目前该疾病尚未解决的问题,设立研究目标,设计实验内容,实施实验过程,撰写科研论文。通过发现问题,提出问题,到形成方案解决问题,环环相扣,从而更好地培养学生独立思考和积极探索的能力,提升科研素质。

小鼠急性心梗模型建立学习曲线及专业实验技能培养

目的总结本实验室建立小鼠急性心肌梗死模型的学习曲线,实验室技术人员在医学研究生培养中的作用。方法4名有理论基础无外科基础实验室技术人员,进行小鼠急性心肌梗死模型建立的培训,从术前死亡率、冠脉结扎准确度及模型建立所需时间及稳定性角度进行评价。结果经过至少1个月培训,可以将术前小鼠死亡率降低至合理范围(小于5%);经过至少六个月训练,心肌梗死模型可以在(20±2)min完成,稳定性较好[四周后,左室射血分数为(18±2)%]。结论实验室技术人员在研究生培养中起到重要作用,尤其是一些对时间、技能要求较高的平台型技术,更是不可或缺。

主动脉瓣关闭不全解剖结构CT精准评估与术中实际测量的对比研究

目的对主动脉瓣关闭不全患者进行主动脉瓣CT精准评估,为手术方式选择与手术方案制定提供参考依据。方法对主动脉瓣关闭不全患者常规行术前全心动周期CT检查,用Mimics软件对影像数据进行评估,2021年1月到2022年1月期间对125例用CT精准评估的方法对拟手术的主动脉瓣进行测量评估;对69例患者术中实际测量主动脉瓣瓣叶几何高度(gH)和游离缘长度(FML),用Bland-Altman图一致性分析CT精准评估与术中实际测量的一致性。结果两种方法测量主动脉瓣瓣叶gH,差值均数为0.1 mm,95%可信区间(CI):-1.9~2.1 mm,有2个点在CI以外;测量瓣叶FML,差值均数为0.4 mm,95%CI:-1.8~2.6 mm,有1个点在CI以外,差异在临床上可以接受。结论CT精准评估与术中实际测量瓣叶gH和FML的一致性好,是主动脉瓣术前测量评估解剖结构的准确方法,可作为主动脉瓣关闭不全修复术前患者选择和手术修复的重要参考依据。

补体1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9改善急性心肌梗死小鼠心脏功能和减轻心肌组织纤维化

目的探究补体1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9(CTRP9)对减轻急性心肌梗死(AMI)后心肌组织纤维化的作用及其机制。方法构建小鼠AMI模型,使用超声机检测左心室射血分数(LVEF)评估心脏功能,应用免疫荧光染色检测α-SMA/Vimentin双染阳性细胞、心肌组织不同区域CTRP9表达情况,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清CTRP9、转化生长因子(TGF)-β1含量,通过Masson染色检测小鼠心肌纤维化情况,Western Blotting检测心肌组织胶原蛋白Ⅰ、TGF-β1、蛋白激酶A(PKA)、p-PKA表达情况。结果小鼠AMI后第4天,血清CTRP9水平减低(P<0.001)、TGF-β1水平升高(P<0.001);AMI后第28天,LVEF显著减低(P<0.001),心肌纤维化明显增加(P<0.001),心肌组织TGF-β1水平明显升高(P=0.0025),肌成纤维细胞数量大量增加(P<0.001),PKA活性增强(P=0.0023),胶原蛋白Ⅰ表达明显增加(P=0.0238);敲除CTRP9小鼠AMI组(10/22)较野生型小鼠AMI组(10/27)死亡率增加,但生存曲线未达到统计学差异,心脏收缩功能进一步减低(P=0.0010),心肌纤维化更加严重(P=0.0395),PKA活性受到部分抑制(P=0.0063),TGF-β1(P=0.0126)、胶原蛋白Ⅰ(P=0.0090)表达增加更多;补充rCTRP9后,AMI组小鼠死亡明显减少,但生存曲线未达到统计学差异;心脏收缩功能明显改善(P<0.001);心肌纤维化明显减轻(P<0.001);PKA活性升高(P<0.001),TGF-β1(P<0.01)、胶原蛋白Ⅰ表达减少(P<0.01),应用PKA抑制剂H-89阻断后,CTRP9的心肌保护作用被阻断。结论CTRP9通过PKA通路明显减轻AMI小鼠心肌组织纤维化和改善心脏功能。