奥密克戎BA.1感染后成人细胞免疫和体液免疫指标定期动态观察分析

目的分析感染奥密克戎变异毒株BA.1后患者的免疫学特征和抗体变化规律,以评估二次感染的可能性。方法纳入2022年1月8日至2月2日天津市津南区感染BA.1的患者104例,对照组与病例组按照年龄、性别和接种疫苗情况1∶1匹配。采集病例组患者感染后第3、6和9个月血清,同期采集对照组的血清。从细胞免疫和体液免疫两方面进行分析,采用ELISA法检测患者血清白细胞介素4(IL-4)、IL-5及γ干扰素浓度(IFN-γ)以及IgG、IgG1和IgG2的阳性率。结果BA.1感染后6个月病例组患者IFN-γ浓度最高为145.4 pg/ml,随后浓度降低;IL-4与IL-5浓度在感染后6个月开始降低(均P<0.001),在BA.1感染后6个月病例组IgG2阳性率与同期对照组无差异,而第9个月时较对照组下降明显(P=0.003);BA.1感染后3个月IFN-γ/IL4的比值病例组低于对照组(P<0.001),至感染9个月后病例组与对照组无明显差异。结论感染BA.1第3个月患者细胞免疫功能处于受损状态,6个月后机体特异性细胞免疫和体液免疫功能明显下降,二次感染风险上升。

柯萨奇病毒B组3型天津分离株的全基因组特征分析

目的对天津市柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)分离株进行基因分型及全基因组特征分析,完善天津市CVB3病毒进化信息,为相关疾病的监测预警提供依据。方法对在天津分离到的5株CVB3毒株提取病毒RNA,通过反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增病毒全基因组序列,使用二代测序方法进行全基因组序列测定,对病毒全基因组序列进行系统进化与重组分析。结果本研究中5株CVB3毒株开放阅读框1(open reading frame,ORF)均含有6555个核苷酸,编码2185个氨基酸,ORF2均由编码68个氨基酸大小的序列构成。核苷酸序列相似性为78.3%~100%,氨基酸序列相似性为95.7%~100%。而5株病毒与病毒原型株相比,核苷酸序列相似性为78.2%~79.1%,氨基酸序列相似性为94.9%~95.3%。5株病毒均在VP2蛋白上出现T151A位点突变,此外脑炎分离株还存在VP2蛋白K158E位点突变,1株生活污水分离株在5'非编码区存在C234T突变。5株病毒分属2个不同基因型,其中2016年的脑炎分离株属于D基因型,而2021年的外环境生活污水分离株属于E基因型,这也是我国北方地区首次报道E基因型CVB3。本研究的CVB3毒株在非结构蛋白区可能存在重组事件,其中脑炎分离株可能与1株柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)毒株发生重组,而生活污水分离株与1株埃可病毒18型(ECHO virus 18,E18)毒株存在重组事件。结论天津市CVB3分离株分属D与E基因型,病毒基因组在非结构蛋白区可能存在重组事件。外环境生活污水中CVB3病毒基因组分析结果提示天津市人群有CVB3感染存在,同时其流行优势基因型可能发生了转变。

手足口病柯萨奇病毒A2、A4和A5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型。方法根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠrRT-PCR方法。分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100~109和102~105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR GreenⅠrRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果。结果成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μl质粒标准品,变异系数均<2%,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应。检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9%(CVA4)、8.33%(CVA5)和7.14%(CVA2),经测序验证符合率为100%。结论建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠrRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测。

天津市2008-2015年手足口病流行病学特征及病原学监测分析

目的探讨天津市手足口病的流行情况和病原学特征。方法收集2008-2015年国家传染病报告信息系统中报告的天津市临床诊断的手足口病病例的疫情资料,采集11 901例临床诊断手足口病的病例标本对其进行肠道病毒检测。结果 2008-2015年天津市手足口病的高发年份为2010年,发病率为229.43/10万,高发月份为6~7月份,高发年龄为1~3岁,津南区、静海区和蓟县为高发区县。重症病例发生率仅为0.15%,主要发生在6~7月份,主要病原为EV-A71,占87.00%。2008-2012年天津市手足口病的主要病原为EV-A71,分布占全部阳性病原的85.88%、43.17%、44.32%、49.24%和40.41%。2013年和2015年以CV-A6为主,分别占54.69%和41.01%,2014年以CV-A16为主占34.38%。重症病例和轻症病例的病原构成经χ~2检验,差异有统计学意义(P=0.000)。结论在手足口病高发季节前应对重点地区、重点人群进行宣传预防,以防止手足口病大范围暴发流行。

中国天津市一例缅甸输入基孔肯雅热病例的病毒基因分型

目的对天津市1例输入基孔肯雅热病例开展病毒基因分型,确定基孔肯雅病毒(CHIKV)与全球主要流行株的关系。方法提取临床症状疑似为CHIKV感染患者血清中RNA,采用荧光定量RT-PCR法检测CHIKV核酸。两步RT-PCR法扩增编码CHIKV包膜糖蛋白E1的基因,扩增产物经测序后开展测序分析。将测序结果与全球其他地区流行毒株一同构建系统发生树。结果天津市输入型CHIKV基因分型属于能够感染白纹伊蚊并在其体内繁殖的东/中/南非基因型印度洋亚型(ECSA-IOL)。系统发生树分析表明,此次输入的CHIKV与2016-2017年在巴基斯坦、意大利、孟加拉国等国家流行的CHIKV毒株高度同源,序列的同源性高达99.4%,并与这些国家流行的CHIKV毒株共同组成1个基因分型簇。结论此次输入性基孔肯雅热病例感染的毒株更容易在人群中传播,提示应加强对基孔肯雅热输入性病例的防控工作,以防止该蚊媒传染病在我国发生本地聚集性传播。

2009～2015年天津市健康人群人肠道病毒71型血清中和抗体动态变化研究

了解天津市健康人群人肠道病毒71型(EV-A71)中和抗体动态变化,为手足口病防控提供依据。2009~2015年共采集5 654名天津市健康人的血清进行EV-A71中和抗体测定,结果提示EV-A71中和抗体总阳性率为82.03%,5岁及以下年龄组的抗体阳性率最低为68.28%,随着年龄增长,抗体阳性率逐年增加。不同年份、不同区域、不同年龄组间的抗体阳性率差异均有统计学意义。以健康人群EV-A71中和抗体阳性率作为应变量,对健康人群的卫生习惯及环境等进行Logistic回归分析,发现半年内未有医院出入史和饭前洗手是保护性因素。EVA71中和抗体阳性率与病原阳性率呈负相关,第一年的抗体阳性率高,第二年的EV-A71病原阳性率则低。5岁及以下儿童和流动人口较多地区应作为手足口病防控的重点,EV-A71抗体阳性率可以做为估测下一年度EV-A71引起EV-A71手足口病流行趋势的依据。

天津市致病毒性脑炎柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

肠道病毒是我国病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)的主要病原体。本文研究对4株引起VE的天津柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)分离株进行Illumina MiniSeq高通量测序,并对其全基因组特征、进化及重组特点进行分析。结果提示,4株CV-B5天津分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.5%~100.0%和98.1%~100.0%,与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为83.2%~96.5%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.4%。基于全基因组的系统进化分析将CV-B5流行株分为A-D四个基因型,其中天津与国内流行株均属于C基因型。C基因型进一步分为3个进化分支,而天津分离株处在两个不同的分支上。基于基因组各区段序列的系统进化与SimPlot重组分析结果显示,天津分离株15-39N、15-41N与埃可病毒30型(Echovirus 30,E-30)原型株在P3区3B、3C、3D区域均检测到重组信号。本研究有助于了解CV-B5的全基因组特点和重组规律,为相关疾病的防控提供依据。

2014-2016年天津市致病毒性脑炎人类肠道病毒基因特征分析

目的了解天津市引起病毒性脑炎的人类肠道病毒(HEV)构成及其基因特征。方法收集2014-2016年天津市病毒性脑炎患者脑脊液和血清标本,通过细胞培养法分离病毒,采用RT-PCR分段扩增HEV VP1区全长序列并测序,进行同源性分析和基于VP1完整编码区的系统进化分析。结果从82份HEV阳性标本中分离到13株HEVB病毒,分离率15.85%,其中8株CV-B5型,2株E-6型,CV-B3型、E-18型、E-30型各1株。系统进化分析,天津市8株CV-B5与国内流行株C基因型亲缘关系较近,且分为两个不同的分支;HEV-B其它血清型均与国内流行株亲缘关系较近。结论天津市致病毒性脑炎HEV病原谱呈多样性特点,其中CV-B5为优势病原体,属于C基因型,且可能存在两条不同的传播链。

2013-2017年天津市柯萨奇病毒A6型分离株基因特征分析

目的分析天津市引起手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)VP1区基因特征。方法收集2013-2017年分离自天津市HFMD患者的CV-A6毒株,采用RT-PCR扩增VP1区基因全长序列并测序,使用DNAStar 5.01软件进行同源性分析,使用MEGA 5.05软件进行基于VP1完整编码区的系统进化分析。结果 38株CV-A6分离株之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为87.4%~100.0%和93.3%~100.0%;系统进化分析显示,38株CV-A6均为D基因型,其中2013年2株为D2基因亚型,其余36株均为D3基因亚型。D3亚型又可分为D3a和D3b2个进化分支,其中32株属于D3a分支,4株属于D3b分支。结论 2013-2017年天津市致手足口病CV-A6流行株主要为D2和D3基因亚型,D3基因亚型又包括D3a和D3b两个进化分支,并以D3a进化分支为主,且呈隔年高发态势。

荧光定量RT-PCR检测柯萨奇病毒A组6和10型的方法建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组6（Coxsackievirus A6,CVA6）和10型（CVA10）的SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并进行评价及初步应用.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法体系,并分别进行灵敏度,重复性和特异性检测,然后利用该方法对649份2014年天津市未明确分型的肠道病毒阳性标本进行检测.结果 成功建立CVA6和CVA10的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法及定量标准曲线,其检出限均为101 copies/μL,重复性实验的变异系数均小于2％.该方法特异性强,与柯萨奇病毒（A组2、4、5、16型）、肠道病毒EV71型、诺如病毒、轮状病毒、麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应.利用该方法检测649份未分型标本,发现136份为CVA6阳性和174份为CVA10阳性,分别占未分型阳性标本的20.96％和26.81％.结论 本研究建立的检测CVA6和CVA10荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好、特异性强,应用于2014年天津市手足口病监测,发现C VA6和CVA10已成为优势型病原体.

天津市输入性基孔肯亚病毒全基因组序列分析

目的分析天津市1例输入性基孔肯亚病毒(CHIKV)的全基因组序列特征与进化,为CHIKV的监测与防控提供科学依据。方法收集2019年11月4日于天津市第二人民医院采集的血清标本200μl提取核酸,设计叠瓦式引物扩增CHIKV基因组全长,然后利用Illumina Miniseq平台进行高通量测序。结果本研究的CHIKV属于ECSA基因型印度洋分支,与大部分中国分离株一致,相似性为92.72%~99.86%,在国际上与巴基斯坦分离株亲缘关系最近(99.74%)。天津CHIKV在关键位点E1-D284E和E2-I211T处有两处突变,与ECSA基因型一致。此外,天津CHIKV还具备两个关键毒力位点E2-12T和E2-82G,以及nsP3-R524Opal终止子突变。结论天津CHIKV具备较强毒力,且具备在白纹伊蚊中传播的能力,提示应继续加强对CHIKV的监测。

天津市2015年病毒性脑炎哨点监测分析

目的通过对病毒性脑炎的症状进行监测,及时发现疫情,了解天津市病毒性脑炎的主要病原及流行特征。方法哨点医院对2015年就诊的病毒性脑炎病例开展流行病学调查,采集血液和/或脑脊液标本运送至天津市疾病预防控制中心,采用RT-PCR和ELISA方法进行病原学检测,检测种类为肠道病毒(EV 71、Cox A16、其他肠道病毒)、腮腺炎病毒(Mumps)、乙脑病毒(JEV)、单纯疱疹病毒(HSV I+II)、巨细胞病毒(CMV)。结果 2015年共监测119例病毒性脑炎病例,男女性别比为1.83∶1,各年龄组均有发病,以10岁以下儿童发病最多(42.02%);职业分布以学生病例为主,占30.25%。全年均有发病,6~10月发病占全年的71.43%。119例病例中有44例病原检测阳性,以肠道病毒阳性率最高,为52.27%(23/44);其次是单纯疱疹病毒(27.27%,12/44)和腮腺炎病毒(15.91%,7/44)。发热、头痛、呕吐为病毒性脑炎的主要症状,病原阳性和未检出病原的病毒性脑炎发热、头痛、恶心、呕吐、嗜睡、意识障碍等症状的比例差异无统计学意义。结论天津市病毒性脑炎主要发生在10岁以下儿童,肠道病毒是主要的病原体,其次是单独疱疹病毒和腮腺炎病毒。在加强病毒性脑炎监测的同时,应建立快速敏感的检测方法以进一步阐明其病原学特征。

柯萨奇病毒A组天津分离株的分型鉴定及分子特征分析

目的 鉴定天津市手足口病病原体柯萨奇病毒A组2、4、5、6和10型,并分析其VP1区基因及分子流行病学特征.方法 提取45株非EV71非CV-A16肠道病毒分离株核酸,利用RT-PCR法扩增其VP1基因并测序,然后根据VP1区基因核酸序列,进行肠道病毒型别鉴定和同源性分析,构建种系发生树.结果 45株非EV71非CV-A16肠道病毒天津分离株分别为6株柯萨奇病毒A组2型（Coxsackie virus A2,CV-A2）,14株CV-A4,3株CV-A5,8株CV-A6和14株CV-A10.柯萨奇病毒各型的株间核酸序列同源性均在80％以上,各型分离株与原型株的同源性均在71.2％ ～ 85.8％之间.天津各型分离株在种系发生树上均聚集于各自相对独立的分支,与国内流行株处在同一分支内,而与国外原型株处于不同的进化分支.结论柯萨奇病毒A组2、4、5、6和10型成为天津市手足口病的流行病原体,各型天津分离株株间核酸序列同源性较高,呈现一定的区域聚集性.

天津市新型冠状病毒肺炎确诊病例新型冠状病毒全基因组特征分析

目的对天津市新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)国内感染和境外输入确诊病例的上呼吸道标本进行新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)全基因组序列测定,并完成基因变异位点和进化分析。方法对天津市COVID-19国内感染和境外输入确诊病例共24例的上呼吸道标本进行核酸提取,构建DNA测序文库,第二代测序仪上机测序,拼接测序数据,通过基因比对和构建进化树完成病毒基因变异位点和进化分析。结果24例COVID-19确诊病例上呼吸道样本2019-nCoV测序结果均与参考株Wuhan-Hu-1高度同源,相似度均大于99.9%;6例国内感染病例2019-nCoV为谱系S,其余18例2019-nCoV为谱系L;境外输入病例2019-nCoV有48个突变位点,国内感染病例2019-nCoV有14个突变位点;15例境外输入病例2019-nCoV中发现D614G突变,国内感染病例2019-nCoV均无此突变。结论天津市COVID-19确诊病例中,境外输入病例病毒基因组有更多的核苷酸变异位点,并且大多数出现D614G突变,传播能力更强。

天津滨海新区本土疫情新型冠状病毒全基因组测序和溯源分析

目的对引起天津滨海新区本土新型冠状病毒肺炎(COVID-19,简称新冠肺炎)疫情的新型冠状病毒(SARS-CoV-2,简称新冠病毒)进行全基因组溯源及变异情况分析。方法对2020年11月7日至12月5日采集的天津滨海新区新冠肺炎疫情1例本地无症状感染者和5例确诊病例咽拭子样本进行全基因组高通量测序,De novo拼接测序数据,使用MAFFT v7.0多重序列比对程序和MEGA X软件对上述数据进行比对和构建系统进化树(Neighbor-joining法)。结果6株新冠病毒序列与武汉参考序列(Wuhan-Hu-1)基因相似度均大于99.9%;6株病毒中2株基因完全相同,符合L基因型欧洲家系分支Ⅱ.1(北美分支)/B.1特征;另外4株基因完全相同,符合L基因型欧洲家系分支Ⅰ/B.1.1特征,此6株新冠病毒序列分属不同的进化分支,为两条不同的传播链。6株新冠病毒序列共有18个核苷酸突变位点,其中8个位点是同义突变,9个位点为错义突变,产生9个氨基酸突变位点,均发现RdRp-P323L、S-D614G重要变异位点。结论本研究中天津滨海新区新冠肺炎疫情为两起事件,6株新冠病毒序列分属不同的进化分支,为两条不同的传播链。提示可能来源于搬运工人接触了已污染新冠病毒的不同来源进口冷链物品。6株新冠病毒序列均有P323L、D614G突变,病毒突变、传播能力更强,应持续加强天津冷链重点从业人员及本土、输入性病例的监测。