环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究

对本实验室分离的1株产脂肪酶克雷伯氏菌A2（Klebsiellasp．A2）的产酶条件进行优化，并对其粗酶性质进行初步的研究，为该酶的进一步开发利用奠定一定基础。该菌的最佳产酶培养基为（m／V）：蛋白胨1．0％，MgSO4·7H200．05％，K2HP041．0％，KH2P040．45％，2．0％的菜籽油。发酵条件：pH值6．5～7．5，28℃，200r／min摇床振荡培养3d。酶学性质表明：该酶的最佳催化温度和最适催化pH值分别为40℃和pH值8．0，该酶的热稳定性较差，在60℃保温1h时丧失50％的活性。Mg2＋，Ca2＋和K2＋能刺激该酶的活性，而低浓度的EDTA和SDS对该酶有明显的抑制作用。

狂犬病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性的研究

目的在昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白(NP),并探讨重组NP的免疫原性.方法采用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达狂犬病毒核蛋白,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析,以感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液免疫小鼠,检测表达产物的免疫原性.结果重组杆状病毒在昆虫细胞中获得表达,免疫小鼠可产生抗核蛋白抗体.结论在Sf9昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白,重组产物具有生物活性.

基因预测与PCR技术相结合从cDNA文库中获取表达基因的研究

应用计算机工具、GenScan软件预测中国美利奴绵羊MHC Class I区段的BAC文库中453oⅡ克隆的基因数目、特性及结构,建立一种可以从cDNA文库中简便有效获取表达基因的技术方法。选取4个预测基因作研究对象设计引物,应用PCR技术,对已构建好的cDNA文库进行PCR扩增,回收"目的基因"片段并连接pGEM-T载体,转DH5α大肠杆菌中扩增后测序。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,cDNA文库中有目的条带,测序结果与GenBank进行Blast分析,分析结果表明这些基因与羊的基因均具有99%以上的相似性。因此应用基因预测分析与PCR结合技术可简便迅速的从cDNA文库中获取表达基因。

丙酮固定时间对皮肤冰冻切片免疫荧光染色的影响

自身免疫性皮肤病是由于自身抗原发生免疫反应导致机体产生各种临床病理现象。目前,直接免疫荧光(DIF)已成为检测抗原/抗体的重要辅助方法。已有研究表明利用丙酮固定对冰冻切片组织的免疫荧光效果更好[1],虽然得以优化,但若固定时间过度延长,可能会影响结果的准确性。本研究应用21例皮肤样本进行丙酮固定,观察不同固定时间对荧光染色的变化,为获得更理想的荧光染色结果提供参考意见。

棉籽毛油生产生物柴油工艺的研究

以棉籽毛油为原料,经过简易的加碱精炼反应后,在催化剂NaOH作用下,通过酯交换反应制得生物柴油,考察反应条件如醇油摩尔比、催化剂用量、反应温度、反应时间等的变化对产率的影响,得到的最佳反应条件为醇油摩尔比6∶1、催化剂用量0.9%、反应温度40℃、反应时间40min。

白色念珠菌的快速检测技术开发

目的利用白色念珠菌单克隆抗体建立一种快速检测临床标本中白色念珠菌的方法。方法利用免疫层析技术,采用双抗夹心法制作成检测白色念珠菌的检测卡。利用标准菌株及临床标本对检测卡的最低检测限、交叉反应进行评估。与荧光PCR核酸扩增法进行试验对比,评估其灵敏度、特异度。结果该方法的最低检测限为10^4 cfu/mL,对可能造成交叉反应的临床常见的菌株,如热带念珠菌、克柔氏念珠菌、曲霉、金黄色葡萄球菌等真菌和细菌进行检测,均无交叉反应。该检测卡的灵敏度及特异度分别为80.00%和97.00%,与荧光PCR核酸扩增法进行对比,差异有统计学意义(P<0.05),Kappa值为0.737,两种方法一致性一般。结论该研究建立了一种灵敏度、特异度、准确度较高的,能快速检测临床标本中白色念珠菌的方法,对于有临床症状而快速检测结果为阴性的标本,建议进行荧光PCR核酸扩增法检测。

全量程C-反应蛋白定量检测试剂盒的研制

[目的]基于荧光定量免疫层析技术,开发一种全量程C-反应蛋白(C reactive protein,CRP)定量检测试剂盒。[方法]采用双抗体夹心法,检测人血中的CRP浓度水平。[结果]该方法的灵敏度为0.1 mg/L,线性范围为0.0～150 mg/L,批内变异系数为8.94%～13.39%,批间变异系数为10.0%～16.8%,相对偏差小于10%,40例临床标本的测试结果显示该试剂与国外试剂的测定结果具有良好的相关性,相关系数r>0.97.具有良好的相关性。[结论]建立一种操作简便,灵敏度高,有良好准确性和重复性,线性范围较宽,满足临床检验需求的全量程C-反应蛋白检测试剂盒。

微生物絮凝剂处理模拟乳品废水及蛋白回收的研究

采用微生物絮凝剂(MBF)进行模拟乳品废水处理和蛋白回收的试验研究。分析研究了搅拌程序、MBF投加量、CaCl_2投加量、加碱量、加碱的顺序对模拟乳品废水(COD为1 260 mg/L)的絮凝沉淀效果。结果表明:对于1 L的模拟乳品废水,最佳的絮凝方式为快搅拌400 rpm(3 min),慢搅拌150 rpm(2 min),慢搅拌50 rpm(10 min),静置(15 min);其中,在快搅拌启动时先投MBF 4 mL,再投3 mL的10%CaCl_2,快搅拌1 min时投5 mL的0.1 N NaOH。在最佳的絮凝方式处理下,原水浊度去除效率达95.86%,原水COD去除效率达71.03%,污泥中蛋白质回收率为76.4%,脂类回收率为84.9%,糖类回收率为14.8%。证明微生物絮凝剂能有效处理废水并回收大部分的蛋白质和脂类。

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株,命名为Beijing(H)株。遗传分析表明Beijing(H)株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97.6%～99.1%和97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性分别是97.6%～99.2%和97.7%～99.8%。结论Beijing(H)株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。

温州市瓯海地区汉坦病毒的分子流行病学调查

目的研究温州市瓯海地区宿主携带汉坦病毒的状况和型别。方法经间接免疫荧光（IFA）试验初筛为阳性的鼠肺标本，用巢式RT—PCR扩增阳性标本中汉坦病毒的S基因片段上的目的核苷酸序列（620～999nt），并以ClustalX（1．831和Phylip3．63构建系统进化树进行分型和分子进化分析。结果温州市瓯海地区共捕获啮齿动物148只，5份鼠肺标本中汉坦病毒抗原阳性，其中褐家鼠3只，黄胸鼠2只，病毒携带率为3．38％，与汉坦病毒分型标准比较，均属于SEOV型。结论瓯海地区褐家鼠和黄胸鼠携带S1和S3亚型汉坦病毒，显示出汉坦病毒的多样性。

新型半定量精斑检测试纸条的研制及法医学应用

目的基于免疫层析技术,开发一种新型半定量精斑检测试剂条。方法采用双抗体夹心法,其中1株PSA单克隆抗体和1株羊抗小鼠IgG多克隆抗体分别包被在硝酸纤维素膜的T线(有两条线——T1和T2)和C线上;另外1株PSA单克隆抗体用彩色微球进行标记后,固定在玻璃纤维素膜上,制备成精斑检测检测卡,对其灵敏度及特异性等性能进行评估后,测试以下4个PSA内部校准品浓度(4ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、500ng/mL),并对45份标本进行检测(其中有13份为陈旧精斑)。结果该方法的灵敏度为4ng/mL,检测的符合率为100%,检测高浓度样品(500ng/mL)时无明显的HOOK效应。能通过T1、T2线的显色情况判断检测样品的大致浓度,如当标准品浓度为4ng/mL时,仅有一条T1线及C线显色;当标准品浓度为40ng/mL时,T1、T2及C线均能显色,且T1线显色强度大于T2线;当标准品浓度为200ng/mL时,T1、T2及C线均能显色,且T2线显色强度大于T1线。结论建立了一种操作简便、灵敏度高,有良好准确性和重复性,可以有效避免HOOK效应且能对检测样品进行半定量检测的精斑试剂条检验方法。

微滴单细胞培养技术应用于白色念珠菌培养的研究

目的为提高白念菌感染的检出率及建立微滴单细胞培养检测方法提供依据。方法将白色念珠菌标准菌株分别接种在4种不同培养基上培养,将临床标本加入到含青霉素和链霉素(双抗)的培养基中进行微滴培养。结果白色念珠菌标准菌株在营养肉汤培养基中生长最快。临床样本在含双抗的培养基的生长速度6 h后快于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。临床样本经过18 h的微滴单细胞培养和液态培养,细胞数量大于0 h,差异有统计学意义(P<0.05)。结论临床样品在含双抗的营养肉汤培养基微滴单细胞培养18 h后再进行检测能够提高白色念珠菌感染的检出率。

定量检测人精斑试剂盒的开发及法医应用

基于荧光定量免疫层析技术,开发一种能定量检测精斑中PSA含量的检测方法。采用双抗体夹心法,将1株PSA单克隆抗体1和1株羊抗小鼠IgG多克隆抗体分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线上,另外1株PSA单克隆抗体2用荧光微球进行标记并包被在结合垫上,制作成检验试剂卡。评估其灵敏度、测量范围、特异性(抗干扰能力)、精密度、准确度。结果显示,该方法的的灵敏度为1ng/nL,测量范围为1~400ng/mL,检测浓度为10.00ng/mL的标准品,重复性良好(CV%<5%),抗干扰能力较强(人血清、唾液、阴道分泌物、人初乳等均无交叉反应),检测45份标本进行检测(其中有13份为陈旧精斑),符合率高达100%。