前癃通胶囊介导miR-216a-5p/TPT1/mTORC1通路调控良性前列腺增生的实验研究

目的通过细胞实验探讨前癃通胶囊(qian long tong capsule,QLTC)能否通过调控miR-216a-5p/肿瘤蛋白翻译控制1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1,miR-216a-5p/TPT1/mTORC1)信号通路抑制良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)。方法将25只大鼠随机分为对照组(等体积生理盐水),QLTC低(56.25 mg/mL)、中(112.50 mg/mL)、高(225.00 mg/mL)剂量组,LBSC组(168.75 mg/mL),每组5只。每组灌胃1 mL/次,2次/d,连续5 d。各组大鼠麻醉后制备含药血清。根据实验目的不同,将CP-H022细胞分5步做实验处理,每部分实验进行独立分组。将miR-216a-5p过表达和沉默表达,及TPT1过表达进行对照研究;RT-qPCR法检测正常和BPH模型CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量,并观察不同浓度QLTC处理的BPH细胞中miR-216a-5p表达量的差异;细胞集落形成实验检测细胞增殖能力;CCK-8法检测BPH模型细胞增殖;RT-qPCR法检测miR-216a-5p、TPT1 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;生信分析、双荧光素酶实验验证miR-216a-5p与TPT1的靶向关系;过表达TPT1后,Western blot法检测BPH细胞中TPT1/mTORC1信号通路相关分子表达情况。结果与对照组1比较,模型组1的CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量下调(P<0.05);不同浓度的QLTC均能上调miR-216a-5p表达量(P<0.05);根据本实验结果,本研究将选用QLTC(高剂量)组CP-H022细胞进行后续实验。与模型组2比较,QLTC组2细胞增殖减少、凋亡增加(P<0.05),B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达降低(P<0.05),Bcl-2关联X蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein,Bax)、cleaved Caspase-3表达升高(P<0.05)。敲低miR-216a-5p后,与模型组4比较,QLTC组4细胞增殖增强、凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达降低(P<0.05)。与mimic-NC组比较,miR-216a-5p mimic组TPT1表达量降低(P<0.05);QLTC处理后,细胞TPT1、p-mTORC1表达均降低(P<0.05);过表达TPT1后BPH细胞增殖功能增强(P<0.05),凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达下降(P<0.05)。结论QLTC可通过介导miR-216a-5p下调TPT1/mTORC1通路,进而抑制BPH。

黄芪甲苷对高糖受损间充质干细胞生物学功能和分泌HGF的影响

目的:探讨黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对高糖受损间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)生物学功能和分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响。方法:无菌条件下取足月健康新生儿胎盘脐带血,经密度梯度离心分离出人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs),分别进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。将鉴定成功的hUCBMSCs用30 mmo1/L葡萄糖预处理120 h后,用不同浓度梯度AS-IV(0、50、100、200、300、400 mg/L)进行干预,确定AS-IV促进高糖受损hUCBMSCs增殖的最适浓度。另将高糖受损hUCBMSCs随机分为实验组和模型组,实验组用最适浓度AS-IV处理,模型组用等体积PBS液处理,同时设置正常组,即等量PBS液处理正常hUCBMSCs。通过CCK-8细胞增殖试验、黏附能力测定试验、细胞划痕试验及ELISA试验检测最适浓度AS-IV对hUCBMSCs增殖、黏附、迁移及分泌HGF功能的影响。结果:AS-IV改善受损hUCBMSCs增殖功能的最适浓度为300 mg/L;模型组高糖受损hUCBMSCs的增殖、黏附、迁移及分泌HGF功能低于正常组(P<0.05);实验组高糖受损hUCBMSCs的增殖、黏附、迁移及分泌HGF功能明显改善,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可促进高糖受损间充质干细胞增殖,改善其分泌功能。

人参皂苷Rg1对人内皮祖细胞增殖、黏附、迁移、成管能力及PDGF分泌水平调控观察

目的观察人参皂苷(GS-Rg1)对人内皮祖细胞(EPCs)增殖、黏附、迁移、成管能力及血小板衍生生长因子(PDGF)分泌水平的调控作用。方法取足月健康新生儿脐带血,培养并鉴定EPCs,将EPCs随机分为实验组和对照组,实验组给予40 mg/L的GS-Rg1,对照组给予等量PBS。培养48 h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,黏附能力测定实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Matrigel体外成血管实验检测细胞成管能力,采用ELISA法检测细胞培养液上清中的PDGF。结果与对照组相比,实验组EPCs增殖能力增高,细胞黏附数增多,细胞绝对迁移宽度增宽,体外成管数增多,细胞培养液上清中PDGF水平增高(P均<0.05)。结论GS-Rg1能提高人EPCs的增殖、黏附、迁移、成管能力,并促进其分泌PDGF。

人参皂苷Rg1对高糖环境下人脐带血间充质干细胞分泌炎症因子水平的影响

目的观察人参皂苷Rg1对高糖环境下人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)分泌炎症因子的影响。方法无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的脐带血,采用密度梯度离心法分离人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)并鉴定。将鉴定成功的hUCBMSCs随机分为正常组、模型组、干预组。模型组和干预组加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基建立高糖受损细胞模型,正常组加入DMEM/F12培养基;培养5 d后,干预组加入40 mg/L的人参皂苷Rg1,正常组和模型组加入等量PBS,继续培养48 h。收集三组细胞上清液,采用酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)水平。结果与正常组相比,模型组细胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1升高(P均<0.05);与模型组相比,干预组细胞上清液中IL-1、IL-6降低,IL-10、M-CSF升高(P均<0.05)。结论高糖环境下,人参皂苷Rg1可抑制hUCBMSCs中的促炎因子释放,促进抑炎因子分泌,从而发挥抑制炎症反应的作用。

人参皂苷Rg1对人脐血间充质干细胞活性和成血管分化的影响

目的探讨人参皂苷Rg1(GS-Rg1)对人脐血间充质干细胞(MSC)体外活性和向血管内皮分化的影响。方法无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的人脐血,经密度梯度离心法分离得到单个核细胞,细胞培养呈长梭形时,进行成骨、成软骨及成脂诱导分化鉴定。将通过鉴定的人脐血MSCs分别用0、5、10、20、40、80 mg/L的GS-Rg1进行干预,确定GS-Rg1促人脐血MSCs增殖的最佳浓度。然后将人脐血MSCs分为实验组和对照组,用最佳浓度的GS-Rg1对实验组进行处理,对照组采用等体积的磷酸盐缓冲液处理。使用CCK-8法研究两组细胞活性,Matrigel实验研究两组体外血管新生的情况。同时用免疫荧光检测内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子-1(CD31)、血管性血友病因子(vWF)表达情况。结果显微镜下可见细胞形态均一,呈长梭形的成纤维细胞样形态,是MSCs的典型形态。成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定染色结果均可见大量深染色部分,显示其为MSCs。GS-Rg1浓度为40、80 mg/L时,人脐血MSCs光密度值高于其浓度为0、5、10、20 mg/L时,差异有统计学意义(P<0.05)。GS-Rg1浓度为80 mg/L时,人脐血MSCs光密度值与其浓度为40 mg/L时比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验组细胞活性、管腔长度及CD31、vWF荧光强度高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论GS-Rg1具有促进人脐血MSCs体外增殖和诱导其向内皮细胞分化及体外血管生成的潜能。

黄芪甲苷干预的EPC-Exos对高糖诱导损伤间充质干细胞向内皮分化的影响

目的探讨黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)干预的人内皮祖细胞外泌体(Endothelial progenitor cells derived exosomes,EPC-Exos)对高糖诱导损伤人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)向内皮分化的影响。方法体外分离和培养人内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),同时体外分离和培养hUCBMSCs,取P4代细胞分别进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。将鉴定成功的EPCs分别用100mg·L-1的黄芪甲苷和等量的PBS干预,培养24 h后收集两组细胞上清液中外泌体。采用透射电子显微镜观察EPC-Exos的形态,利用纳米粒子追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)技术检测EPC-Exos的粒径,Western blot技术进行外泌体特征性标志物CD9、CD63和TSG101的检测。将hUCBMSCs用30 mmol·L-1的葡萄糖预处理120h后,随机分为实验组和对照组,同时设置正常组。三组细胞培养24 h后,通过Matrigel体外成管实验研究EPC-Exos对hUCBMSCs成管分化的影响。免疫荧光检测hUCBMSCs表达CD31、vWF等内皮细胞特异标志物的情况。结果光镜下hUCBMSCs边缘清楚,形态均一,排列呈漩涡状,3系细胞分化为典型图像。透射电镜观察分离及提纯后黄芪甲苷干预EPC-Exos为包膜完整的圆形或椭圆形微囊泡结构;NTA技术检测97.6%人EPC-Exos为直径在81.4-142.1nm之间的微囊泡;EPC-Exos表面特异标志物CD9、CD63、TSG101呈阳性,以上实验证实成功提取EPC-Exos。Matrigel成管实验显示,与对照组相比,实验组MSCs细胞体外成管能力显著增强,差异显著(P<0.001)。免疫荧光检测显示,与对照组相比,实验组MSCs表达内皮细胞特异性标志物CD31、vWF能力显著增强,差异显著(P均<0.01)。结论黄芪甲苷干预的EPC-Exos可有效恢复高糖受损人间充质干细胞的成管功能且显著改善其向内皮分化能力。

阿魏酸对间充质干细胞增殖、分泌干细胞因子和成管分化的影响

目的探讨阿魏酸(ferulic acid,FA)对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖、分泌干细胞因子(stem cell factor,SCF)和定向内皮细胞成管分化的影响。方法取足月健康新生儿脐带血10 mL,采用密度梯度离心法得到单个细胞,并鉴定人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)分化能力。将hUCBMSCs分别用不同浓度梯度的FA(0、1、2、4、8、16 mg/L)干预以确定FA促hUCBMSCs增殖的最佳浓度。取hUCBMSCs随机分为实验组与对照组,实验组用最佳浓度FA干预,对照组用等体积PBS液处理。分别采用CCK-8细胞增殖试验、Matrigel体外成管试验及ELISA法检测两组hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF的能力;采用免疫荧光法检测hUCBMSCs向内皮细胞分化后CD31、vWF的表达情况。结果(1)hUCBMSCs能成功诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞;(2)FA促进hUCBMSCs增殖的最佳浓度为2 mg/L;(3)与对照组相比,实验组hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF能力显著增强,且FA诱导成管分化后CD31和vWF的表达明显增多(P<0.05)。结论FA能促进hUCBMSCs增殖及分泌SCF,同时能诱导hUCBMSCs成管分化,进一步证实FA具有促进血管新生的潜能。

基于生信学数据挖掘和实验验证阿魏酸介导间充质干细胞外泌体调控炎症miRNA表达情况

目的基于生信分析筛选出人脐血间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells-derived exosomes,hUCBMSC-Exos)中可用于调控炎症过程的微小RNA(microRNA,miRNA)。在此基础上,研究阿魏酸(ferulicacid,FA)对hUCBMSC-Exos中与炎症调控相关miRNA的影响。方法从现有数据库中分别筛选hUCBMSC-Exos中的miRNAs和与调控炎症相关的miRNAs,取2组miRNAs的交集,从而获得hUCBMSC-Exos中与调控炎症相关的候选miRNA分子组。取足月健康新生儿脐带血,将分离所得的单个核细胞置于DMEM/F12培养基培养至P4代细胞,进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。实验分为2个部分来验证FA对hUCBMSC-Exos及hUCBMSCs分泌相关炎症因子的作用:(1)将鉴定成功的hUCBMSC-Exos随机分为实验组及对照组,实验组用2 mg·L^(-1)FA干预,对照组用等体积PBS液处理,培养24 h。采用超速离心法结合超滤法提取hUCBMSC-Exos,通过透射电子显微镜观察其形态,蛋白印迹法鉴定其特征表面标志物CD9、CD63和TSG101,采用BCA法测定hUCBMSC-Exos浓度,RT-qPCR法检测各组外泌体中炎症调控相关候选miRNAs的表达。(2)另将鉴定成功的人hUCBMSCs按随机数字表法随机分为实验组、模型组和对照组,实验组与模型组用含30mmo1·L^(-1)的葡萄糖DMEM/F12培养基培养120h,建立高糖诱导损伤hUCBMSCs细胞模型后,实验组用2 mg·L^(-1)FA干预,模型组和对照组用等容量的PBS液处理。每组均培养24 h后用ELISA试剂盒检测3组上清液中炎性因子含量。结果通过对GEO测序数据分析和对文献的筛选最终获得7个在hUCBMSC-Exos中可能高表达且与炎症调控相关的miRNAs:miR-125b、miR-126、miR-145、miR-146a、miR-21、miR-221、miR-31-5p。成功培养、分离和鉴定得到hUCBMSCs,并进一步收集到hUCBMSC-Exos,培养24 h后,实验组hUCBMSC-Exos的浓度为(1.179±0.03)μg·mL^(-1),明显高于对照组(0.881±0.03)μg·mL^(-1)(P<0.01)。与对照组相比,实验组中部分炎症调控相关miRNA变化显著,miR-126-3p和miR-146a-5p显著上升,miR-145及miR-31-5p显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,在2 mg·L^(-1)FA干预下,实验组中hUCBMSCs分泌IL-1β、MCP-1水平明显降低,分泌IL-10、M-CSF明显水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05),2组间IL-6分泌差异无统计学意义。与对照组相比,模型组hUCBMSCs分泌IL-1β、IL-6、MCP-1水平明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05),2组间IL-10、M-CSF分泌差异无统计学意义。结论FA可能通过介导hUCBMSC-Exos中调控炎症的miRNA(miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-145及miR-31-5p)分泌,进一步调控h UCBMSCs分泌相关炎症因子从而调控机体炎症反应,本研究进一步从外泌体水平证实FA具有调控炎症的潜能。为进一步研究FA通过hUCBMSC-Exos调控机体炎症反应奠定坚实基础。

人参皂苷Rg1调控内皮祖细胞分泌外泌体及表达血管新生相关miRNAs的影响

目的探讨人参皂苷Rg1(Ginsenoside-Rg1,G-Rg1)对内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)分泌外泌体(Endothelial progenitor cells derived exosomes,EPC-Exos)及表达血管新生相关微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)的影响,为进一步研究G-Rg1介导的EPC-Exos促血管新生的作用机制奠定基础。方法无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的脐带血,分离得到单个核细胞,置于EGM-2培养基传代培养至P3代,通过CD31免疫磁珠分选法及双荧光染色法共同鉴定细胞。将鉴定成功的EPCs随机分为实验组及对照组,实验组用40mg·L^(-1)G-Rg1干预,对照组用等体积PBS液处理,各培养24h。采用超速离心法结合超滤法提取EPC-Exos,通过透射电子显微镜观察其形态,蛋白印迹法鉴定其特征性表面标志物,BCA蛋白定量法检测总蛋白浓度,RT-qPCR法检测各组外泌体中与血管新生相关miRNAs分子的表达。结果培养24h后,各组EPC-Exos表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。对照组与实验组EPC-Exos总蛋白浓度分别为(0.85±0.02)和(0.97±0.02)ug·uL^(-1),差异显著,有统计学意义(P<0.01)。实验组中部分促血管新生相关miRNAs表达较对照组增多,即miRNA-126-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-210、miRNA-214-5p的表达明显增多,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论人参皂苷(G-Rg1)能促进内皮祖细胞分泌外泌体,使外泌体中与血管新生相关的miRNA-126-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-210、miRNA-214-5p表达明显增多,可进一步从外泌体水平阐释G-Rg1促进血管新生的机制。

黄芪甲苷介导间充质干细胞外泌体对高糖诱导损伤的内皮细胞生物学功能和细胞焦亡的影响

目的探讨黄芪甲苷(AS-IV)介导的间充质干细胞外泌体(MSC-Exos)对高糖诱导损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的生物学功能和细胞焦亡的影响。方法将人脐血间充质干细胞(hUCBMSCs)用400 mg/L的AS-IV干预后提取外泌体,行外泌体形态和特异性标志物鉴定。将HUVECs用30 mmol/L的葡萄糖干预制备成高糖诱导HUVECs损伤模型。将高糖受损HUVECs随机分为实验组和模型组,分别用100μg/ml的MSC-Exos和等体积的PBS液干预;同时设置空白对照组。采用CCK-8细胞增殖试验、黏附能力测定试验、Matrigel体外成管试验、划痕试验检测AS-IV介导的MSC-Exos对HUVECs增殖、黏附、成管、迁移能力的影响;采用Western blot、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组中焦亡相关分子Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白及其mRNA表达情况。结果高糖导致HUVECs细胞增殖、黏附数、成管数、迁移宽度较空白组下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);而Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白及其mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均P<0.001)。而用AS-IV介导的MSC-Exos干预下,HUVECs的细胞增殖、黏附数、成管数、迁移宽度较模型组明显上升,差异均有统计学意义(均P<0.05);Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白及其mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AS-IV介导的MSC-Exos可明显改善高糖诱导损伤内皮细胞的生物学功能,其作用机制可能与抗细胞焦亡有关。

阿魏酸调控内皮祖细胞分泌外泌体及对表达血管新生微小RNA的影响

目的研究阿魏酸调控内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)分泌外泌体(exosomes,Exo)及对表达血管新生微小RNA的影响。方法将EPC随机分为实验组和对照组。实验组加入8 mg·L(-1)阿魏酸干预24 h,对照组用等容量的磷酸盐缓冲溶液干预24 h。用透射电子显微镜观察EPC-Exo形态,用蛋白质印迹法鉴定其特征性表面标志物,用二辛丁酸蛋白定量法检测总蛋白浓度,用实时荧光聚合酶链反应法检测EPC-Exo中血管新生相关miRNA分子的表达水平。结果培养24 h后,各组EPC-Exo呈圆形或椭圆形的膜囊泡结构,EPC-Exo特征性表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。干预24 h后,实验组与对照组的EPC-Exo蛋白浓度分别为(1.01±0.02)和(0.85±0.01)μg·μL(-1),miR-21表达水平分别为2.51±0.34和0.99±0.12,miR-126-5p表达水平分别为3.97±0.45和1.04±0.03,miR-146a-5p表达水平分别为8.04±0.52和1.06±0.05,miR-210表达水平分别为4.77±0.37和1.12±0.03,miR-214-5p表达水平分别为0.74±0.06和0.39±0.02,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论阿魏酸能促进EPC分泌Exo,且EPC-Exo中富含有与血管新生相关的miRNAs。

人参皂苷调控间充质干细胞分泌外泌体及对血管新生相关miRNAs表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1(GS-Rg1)调控间充质干细胞分泌外泌体(MSC-Exo)及对血管生成相关微小RNAs(miRNAs)表达的影响。方法将人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)分为实验组和对照组,实验组加入终浓度为40 mg/L的GS-Rg1,对照组加入等体积的PBS,均培养24 h。采用透射电子显微镜观察MSC-Exo形态,蛋白免疫印迹法鉴定其特征性表面标志物,二辛丁酸蛋白定量法检测MSC-Exo浓度,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MSC-Exo中8种与血管新生相关miRNAs的表达。结果培养24 h后,可见呈圆形膜囊泡结构的MSC-Exo。MSC-Exo特征性表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。干预24 h后,实验组与对照组MSC-Exo蛋白浓度分别为(1.080±0.019)μg/μl和(0.881±0.032)μg/μl,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组miR-126-3p、miR-21、miR-146a-5p、miR-126b-5p表达显著高于对照组,miR-16-5p表达低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论GS-Rg1能够促进MSC-Exo的分泌,并能增强Exo内与血管生成相关miRNAs的表达,促进血管新生。