羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2在细胞抗氧化中的作用及机制研究

目的探讨羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2(LanCL2)在细胞抗氧化过程中的作用及相关机制。方法采用不同浓度(0、30、75、100、150、200μmol/L)的过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导处理人胚胎肾细胞(HEK293T)24 h以诱导氧化应激,通过蛋白质印迹技术检测LanCL2的表达;分别转染GFP、GFP-LanCL2过表达质粒至HEK293T细胞,在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激条件下,通过PI/Hoechst 33342染色检测细胞死亡;向HEK293T细胞中转染Myc、Myc-LanCL2、Myc-GSTP1、Myc-LanCL2-His和GSTP1-His质粒,分别作为Myc组、Myc-LanCL2组、Myc-GSTP1组、Myc-LanCL2-His组(诱导纯化后)和GSTP1-His组(诱导纯化后),将未经任何处理的细胞作为Ctrl组,采用紫外分光光度计检测各组谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性及Myc组与Myc-LanCL2组的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。结果与无H_(2)O_(2)刺激相比,在100、200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后HEK293T细胞中LanCL2相对表达量升高(P<0.05);与GFP组相比,GFP-LanCL2组在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后细胞死亡率下降(P<0.01);Myc-LanCL2组GST活性与Myc组及Myc-GSTP1组相比,差异无统计学意义(P>0.05);与Ctrl组相比,GSTP1-His组具有较高的GST活性(P<0.001);而Myc-LanCL2-His组GST活性与Ctrl组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Myc-LanCL2组GPx活性与Myc组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论LanCL2能被氧化应激诱导,并减轻氧化应激介导的细胞死亡,但LanCL2不具有GSH依赖的抗氧化酶(GST和GPx)活性。

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的构建

目的 通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG_(35-55))多肽两次免疫C57BL/6J小鼠,构建实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。方法 将8周龄C57BL/6J雌性小鼠按随机数字表法分为EAE组和对照组,每组10只。EAE组采用MOG_(35-55)多肽与完全弗式佐剂混合后的抗原乳剂,于小鼠双侧腹股沟和后肢分4点皮下注射,首次免疫后6 d注射相同剂量的抗原乳剂加强免疫,并且于首次免疫后0、48 h腹腔注射百日咳毒素;对照组采用不含MOG_(35-55)多肽的CFA,其余方法同EAE组。观察两组小鼠的行为学表现并进行神经功能评分;免疫后第19天,取两组小鼠的脑和脊髓组织进行Black Gold髓鞘染色和髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色,检测其脱髓鞘情况;小胶质细胞特异性标志物(Iba-1)免疫荧光染色检测两组脑和脊髓组织中小胶质细胞的增殖活化情况。结果 EAE组小鼠在首次免疫后第12天左右开始发病,第19天症状达到高峰,随后开始缓解,发病率为100%,而对照组小鼠只在首次免疫后第14天出现短暂的尾巴无力症状。Black Gold髓鞘染色和MBP免疫荧光染色显示,EAE组小鼠脑和脊髓均出现脱髓鞘;Iba-1免疫荧光染色显示,EAE组小鼠脑和脊髓均出现小胶质细胞增殖活化;而对照组小鼠脑和脊髓并未出现脱髓鞘和小胶质细胞的增殖活化。结论 MOG_(35-55)两次免疫C57BL/6J小鼠,成功构建发病率高的EAE模型,为多发性硬化症的致病机制研究和药物开发奠定基础。