金鲳鱼和南美白对虾混合养殖试验

近年来,由于沿海海域水环境污染加剧、异常气候频发、种苗质量退化等因素,土塘养殖南美白对虾(Litopenaeus Vannamei)(以下简称白对虾)成功率逐年下降,尤其是在6—8月份高温期间,还面临着水浓倒藻、肠炎白便、肝脏萎缩、生长速度慢及偷死等一系列问题。有些养殖户主动寻求转变,改土塘精养为土塘混养,其中以土塘金鲳鱼与白对虾混养模式最有代表性。现开展金鲳鱼和南美白对虾混合养殖试验。1材料与方法1.1时间与地点2023年4月8日—7月15日。试验地位于广西壮族自治区防城港市防城区茅岭镇包屋村。

苦玄参提取物对广西麻鸡血清生化指标及免疫功能的影响

试验旨在研究日粮中添加苦玄参提取物对广西麻鸡血清生化指标及免疫功能的影响。选用1日龄广西麻鸡500羽,随机分为5组(A、B、C、D、E组),每组设5个重复,每个重复20羽。其中A、B、C组为试验组,分别在基础日粮中添加0.70%,0.35%和0.175%的苦玄参提取物;D组为阳性药物对照组,在基础日粮中添加0.01%硫酸黏菌素预混料;E组为空白对照组,饲喂基础日粮,预试期3d,正试期49d。于21、35和49日龄时分别从每组抽取10羽试验鸡进行心脏采血,测定血清生理生化及免疫指标。结果显示:与E组相比,日粮添加苦玄参提取物对鸡的血清TP、GLU含量无显著影响(P>0.05);但21和35日龄时,A、B、C组的TBILI含量均极显著或显著低于E组(P<0.01;P<0.05);35日龄时,A、B、C组的血清AKP活性均极显著高于E组(P<0.01),C组的GOT活性在21和35日龄时显著高于E组(P<0.05);49日龄时,A、B、C组的IgG和B、C组IL-2含量均显著或极显著低于E组(P<0.05;P<0.01),B组T-AOC显著高于E组(P<0.05),A、B、C组血清GSH含量均显著高于E组(P<0.05)。由此可知,日粮中添加的苦玄参提取物显著降低了广西麻鸡的血清TBILI含量,并在一定程度上降低了IgG、IL-2和IL-6含量,提高了AKP和GOT活性及T-AOC和GSH含量。综合考虑,以0.35%的添加量效果最好。

山豆根多糖对感染PRRSV小鼠脾脏细胞因子水平的影响

探讨山豆根多糖对PRRSV感染小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响。将70只昆明种小鼠随机分为7组(A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组),每组10只,雌雄各半,依据前期已经建立氧化应激模型的感染条件,D组、E组、F组、G组小鼠于试验第1、2、3天分别采用口服、滴鼻和腹腔注射3种途径联合感染PRRSV病毒原液1.0mL/只,A组、B组、C组给予生理盐水1.0mL/只。第4、5、6天,A、D组小鼠分别腹腔注射生理盐水,0.2mL/10g。B组小鼠腹腔注射5.0mg/kg的脂多糖(LPS)溶液,C组、E组、F组、G组小鼠分别腹腔注射不同剂量的山豆根多糖(200、50、100、200mg/kg)。供试小鼠均于第14天处死,并取其脾脏制备匀浆。采用ELISA检测脾匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1等细胞因子的水平。结果显示,PRRSV感染小鼠后能升高小鼠脾脏匀浆内TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,50mg/kg^100mg/kg剂量的山豆根多糖能降低上述细胞因子的水平。结果表明,山豆根多糖能有效降低PRRSV感染小鼠脾脏细胞因子的水平。

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据。【方法】PCV2原液调至5×106/m L,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4稀释度)后,感染作用RAW264.7细胞2 h,弃病毒液,加入含5%FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(i NOS)等指标。【结果】10-1 PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和i NOS活性,表明以10-1 PCV2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激。【结论】PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5×105/m L)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件。

“三黄连”合剂抗炎作用研究

通过观察"三黄连"合剂体内对二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型和体外对脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞所致炎性反应的影响,研究该复方制剂的抗炎效果。结果表明,"三黄连"合剂高剂量(30mL/kg)、中剂量(15mL/kg)组小鼠耳肿胀率与空白对照组差异极显著(P<0.01);除中剂量组的胸腺指数外,各试验组小鼠肝脏、肾脏、脾脏和胸腺指数与空白对照组无显著差异(P>0.05)。"三黄连"合剂对LPS刺激的RAW264.7细胞的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的升高具有显著的抑制作用(P<0.05),且呈剂量依赖关系。"三黄连"合剂在体内和体外均具有良好的抗炎效果,并且在体内无明显毒副作用和免疫抑制作用。

马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞活性及炎症相关因子的影响

首先通过MTT法检测马尾藻多糖对3D4/2细胞活性的影响,然后用ELISA法检测炎症相关因子。试验结果,PCV-2感染3D4/2细胞后明显降低细胞活性,马尾藻多糖25、50、100、200、400μg/m L处理后,均能提高感染细胞的活性;PCV-2感染3D4/2细胞后均能显著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的水平,马尾藻多糖处理后,25、50、100、200、400μg/m L均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平,且其中25、50μg/m L的效果最明显。结果表明,马尾藻多糖具有较好的体外抗炎作用,且其抗炎作用机制可能与其抑制炎症因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有关。

猪圆环病毒2型诱导3D4/2细胞氧化应激模型的建立

通过研究不同浓度猪圆环病毒2型(PCV2)对体外感染3D4/2细胞产生氧化应激水平的影响,来确定建立PCV2体外诱导3D4/2细胞氧化胁迫模型的条件。以5个不同浓度PCV2感染组(100、10-1、10-2、10-3、10-4)作用于3D4/2细胞2h,弃去病毒液,加入含100mL/L胎牛血清1640培养液后继续培养,于4、8、12、24、48h分别收集细胞上清液或细胞,测定NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS等指标。10-1PCV2感染3D4/2细胞24h、48h后显著升高细胞NO水平,感染4h^24h显著升高细胞ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG比值;10-1 PCV2感染3D4/2细胞4h、8h显著升高细胞GSSG水平;10-1PCV2感染3D4/2细胞4、8、12、24h均能显著升高细胞XOD、MPO、iNOS活力,提示10-1PCV2感染3D4/2细胞一定程度上改变了细胞氧化还原状态,诱导了细胞产生氧化应激,而病毒感染后48h未检测到PCV2核酸。表明PCV2感染后4h^24h能诱发3D4/2细胞氧化应激,选择10-1PCV2作为氧化应激模型的感染剂量。

IHHNV PCR检测方法改进及广西流行株基因型分析

[目的]建立并优化传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测及其基因分型的套式PCR,并确定IHH-NV在广西流行的基因型,为有效防控广西对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)提供参考依据。[方法]在以PCR检测IHHNV现有标准的基础上,于389F/R和309F/R两对引物扩增片段之外的绝对保守区域设计外引物IHHNV-WF/WR,优化退火温度和引物浓度后建立IHHNV检测及基因分型的套式PCR,并通过与一步法PCR对比以验证其优越性;采用建立的套式PCR对546株2010 2018年收集的IHHNV广西流行株进行基因型分析,确定IHHNV在广西流行的基因型。[结果]优化后的第一轮PCR反应体系20.0 L:2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各0.8 μL,DNA模板2.0 μL,无核菌酶灭菌水补足至20.0 μL。扩增程序:94.0 ℃预变性3 min;94.0 ℃ 10 s,59.0 ℃ 15 s,72.0 ℃ 15 s,进行35个循环;72.0 ℃延伸5 min。套式PCR检测IHHNV的灵敏度较一步法PCR提高100倍;对100份IHHNV阳性临床样品的检测结果与一步法PCR的检测结果一致,符合率达100%。从546株IHHNV广西流行株中均能扩增获得309 bp的目的条带,全部为感染型(基因1型和基因2型)。[结论]在PCR检测IHHNV现有标准基础上建立的IHHNV检测及基因分型套式PCR,其灵敏度较一步法PCR提高100倍,尤其适用于检测IHHNV含量低的样品,可为疫病监测及进出口检疫提供更敏感的技术手段。当前广西流行的IHHNV均为感染型(基因1型和基因2型)。

无证书可认证三方密钥协商协议

为了抵抗主动攻击,2010年陈家琪等人提出了一个可认证的无证书三方密钥协商协议,但该密钥协议不能抵抗被动敌手的攻击,也不能满足他文章中所陈述的一些安全属性。为了解决上述问题,在He De-biao等人的无证书两方密钥协商协议基础上,提出了一个新的无证书可认证三方密钥协商协议。对新协议进行了安全性分析和效率分析,结果表明,新协议满足无证书可认证三方密钥协商协议的安全要求。与陈家琪的协议相比,新协议中的双线性对的个数减少了,因而新协议的计算效率更高。

虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。【方法】根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度。2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性。【结论】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

【目的】建立一种能扩增dna J基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。【方法】以弧菌dna J基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dna J基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性。【结果】优化后的PCR反应体系50.0μL:2×F8 Fast Long PCR Master Mix 25.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各2.0μL,DNA模板5.0μL,灭菌水补足至50.0μL。扩增程序:94℃预变性3 min;94℃10 s,55℃15 s,72℃15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min。该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/m L。应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dna J基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dna J基因序列相似度为98.2%~99.9%。【结论】基于dna J基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dna J基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CP^(MrNV)和pGM-T-MCP^(DIV1)),其中,pGM-T-CP^(MrNV)用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCP^(DIV1)则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×10^(1)~1.0×10^(8)Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障。

黑鲷催乳素基因PRL1和PRL2在急性盐胁迫环境下的表达分析

【目的】明确催乳素基因(PRL1和PRL2)在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达模式,为黑鲷养殖过程中最适盐度范围的确定提供参考依据。【方法】通过RT-PCR扩增黑鲷PRL1和PRL2基因,以ExPASy、NetNGlyc及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测PRL1和PRL2基因在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达情况。【结果】黑鲷PRL1基因开放阅读框(ORF)全长639 bp,共编码212个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为23.32 k D,理论等电点(pI)为6.70;黑鲷PRL2基因ORF全长750 bp,共编码249个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为28.31 kD,pI为8.37。黑鲷PRL1和PRL2蛋白均由1个为信号肽结构域和1个为Hormone 1结构域组成;黑鲷PRL1蛋白二级结构中α-螺旋占69.34%、无规则卷曲占30.66%,包含1个糖基化位点及37个磷酸化位点;黑鲷PRL2蛋白二级结构中α-螺旋占67.07%、无规则卷曲占32.93%,包含1个糖基化位点及21个磷酸化位点。黑鲷PRL1和PRL2基因在12个待检测组织中均有表达,且均以脑组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同);在盐度5‰处理组中,黑鲷PRL1基因在胁迫4 h开始显著上调,黑鲷PRL2基因在胁迫8 h开始极显著上调(P<0.01),二者均在胁迫24 h时达峰值,随后开始缓慢下降,至胁迫72 h时其相对表达量仍显著高于对照组;在盐度25‰和35‰处理组中,黑鲷PRL1和PRL2基因在胁迫72 h时其相对表达量均显著低于对照组。【结论】低盐胁迫能促进黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,高盐胁迫则抑制黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,即黑鲷PRL1和PRL2基因在其适应淡水环境的过程中发挥重要调节作用。

广西地区凡纳滨对虾白斑综合征病毒同源重复区基因的比较分析

为了解广西地区对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)分子变异特征,选取2010-2019年采自广西沿海地区的120份WSSV阳性凡纳滨对虾(Litopenarus vannamei)样品,进行同源重复区ORF75、ORF94和ORF125基因的扩增和测序,并比较分析其重复单元变化差异(Variable number of tandem repeats, VNTR)及单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)。结果显示,ORF75的重复单元(Repeat units, RUs)是45bp(RUs-45 bp)和102 bp(RUs-102 bp),RUs数目存在3、4、6、7、8、9类型,最多的是6 RUs型;ORF94的RUs是54bp(RUs-54 bp),RUs数目有0、1、2、3、4、6、8、9、11、12类型,最多的是2 RUs型;ORF125的RUs前两个是72 bp(RUs-72 bp),第3个之后的RUs为69 bp(RUs-69 bp),RUs有3、5、6、8、9类型,最多的是6 RUs型。SNPs分析结果表明,ORF75的RUs-45 bp的第3、15、30、42、44位存在多态性,RUs-102 bp的第83位存在多态性;ORF94的RUs-54 bp的第48位具有多态性,为G、T或C;ORF125的RUs-72 bp不存在多态性,RUs-69 bp(从第1个到倒数第2个)的第2、12、19、22、37、40、48、53、60、63位具有多态性,第2位为T/C,12和22位为G/T,19位为G/A,37、40、48、53和63位为A/G,60位为C/T,出现较多的位点是第12、22、37、60、63位,其中第60、63位多态性最为普遍。结果表明,WSSV广西株同源重复区存在较大变异,序列的RUs数目和SNP存在多样性。