表皮葡萄球菌临床菌株icaA、icaR基因与生物被膜形成关系的研究

目的研究表皮葡萄球菌icaA和icaR基因与生物被膜形成的相关性。方法收集湘雅三医院机械通气患者分离表皮葡萄球菌26株,按生物被膜成膜能力分成生物被膜阳性菌组和生物被膜阴性菌组各13株。采用RT-PCR分别对2组细菌icaA和icaR基因灰度比进行检测;采用real-time PCR分别检测2组细菌icaA和icaR基因的表达,并通过2-△△Ct方法进行相对定量。结果 RT-PCR结果显示icaA基因在生物被膜阳性组中的灰度比为0.96~1.38,在生物被膜阴性组中为0.89~1.56,表达差异无统计学意义(T=10.65,P=0.057);同理,icaR基因在生物被膜阳性组中的灰度比为0.79~1.24,在生物被膜阴性组中则为0.80~1.36,表达差异亦无统计学意义(T=14.62,P=0.479)。但icaA基因在生物被膜阳性组中的平均秩(16.35)明显高于生物被膜阴性菌组(10.65),而icaR基因生物被膜阳性组的平均秩(12.38)明显小于生物被膜阴性菌组(14.62)。real-time PCR检测发现表皮葡萄球菌生物被膜阳性组icaA基因的表达量(△CT=4.86)是生物被膜阴性组(△CT=13.57)的418.8倍(t=61.890,P<0.01),而icaR基因的表达量(△CT=19.03)仅为生物被膜阴性组(△CT=11.85)的1/145(t=21.330,P<0.01)。结论 icaA基因与表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈正相关,而icaR基因与表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈负相关。

3种液体培养基对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、LB和M-H 3种肉汤培养基对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。方法通过96孔和6孔板构建细菌生物膜,结晶紫染色对其进行半定量分析和显微镜观察生物膜形态,探讨TSB、LB和M-H肉汤培养基对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响;提取细菌总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR检测3种培养基对表皮葡萄球菌粘附基因表达量的影响。结果与LB(0.149±0.047)和M-H(0.323±0.003)培养基相比,TSB(2.954±0.287)培养基能显著促进表皮葡萄球菌生物膜的形成(TSB vs LB,t=16.706,P<0.01;TSB vs M-H,t=15.877,P<0.01);与LB培养基相比,TSB培养基可显著促进表皮葡萄球菌ica A基因的表达(t=9.667,P<0.01)并抑制icaR基因的表达(t=13.283,P<0.01)。结论与LB和M-H肉汤培养基相比,TSB培养基能显著促进表皮葡萄球菌生物膜的形成和粘附基因ica A的表达。

鲍曼不动杆菌分泌物对铜绿假单胞菌及其生物膜的作用

目的探讨鲍曼不动杆菌培养上清对铜绿假单胞菌的浮游菌生长及生物膜形成的影响。方法收集鲍曼不动杆菌标准菌株(ATCC 19606和ATCC 1195)和临床菌株(AB23、AB39和AB53),提取6、12、16、24和48 h培养上清液。利用96孔板结合结晶紫染色法检测其培养上清液对铜绿假单胞菌标准菌株PAO1及其生物膜形成的影响;配制2×LB培养基,排除营养消耗对铜绿假单胞菌的影响;并进一步利用相对分子质量3 000蛋白质浓缩管对其培养上清液进行分离浓缩,初步探讨鲍曼不动杆菌培养上清液中有效成分的相对分子质量。结果 12~24 h内的鲍曼不动杆菌培养上清液,抑制铜绿假单胞菌增殖的效果最为显著,为便于操作,本实验采用16 h培养上清液进行后续实验。50%ATCC 1195和ATCC 19606培养上清液能显著抑制铜绿假单胞菌标准菌株PAO1浮游菌的增殖,可分别使其630 nm处的吸光度从0.688±0.014和0.692±0.014减少至0.431±0.023和0.428±0.020(t=16.780,P<0.05;t=18.500,P<0.05);且50%ATCC 1195和ATCC 19606培养上清液能显著抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成,可使生物膜的形成量(A_(570 nm))从2.071±0.068和1.986±0.023减少至1.639±0.042和1.525±0.202(t=9.358,P<0.05;t=3.924,P<0.05);此外,与50%鲍曼不动杆菌培养上清液组相比,培养上清液中相对分子质量<3 000的成分抑制作用显著,可使生物膜的形成量从1.177±0.040减少至1.056±0.030(t=4.192,P<0.05),而>3 000的成分并无抑制作用。结论鲍曼不动杆菌分泌物能有效抑制铜绿假单胞菌浮游菌的增殖和生物膜的形成,其有效蛋白质成分相对分子质量<3 000。

铜绿假单胞菌生物被膜对巨噬细胞的免疫逃逸作用及机制

目的探讨铜绿假单胞菌生物被膜对巨噬细胞的免疫逃逸作用以及相关机制。方法用PMA刺激THP-1细胞获得巨噬细胞模型。用6孔板建膜法获得铜绿假单胞菌生物被膜菌。分别用铜绿假单胞菌的生物被膜菌和浮游菌感染巨噬细胞,观察巨噬细胞形态的变化,并检测巨噬细胞的细胞毒性和吞噬功能的变化。进一步用ELISA试剂盒检测感染的巨噬细胞培养上清中炎症细胞因子IL-1β的变化。结果成功构建巨噬细胞模型和铜绿假单胞菌生物被膜菌模型。与感染了浮游菌的细胞相比,感染了生物被膜菌的巨噬细胞形态变化小,释放的LDH降低,吞噬功能减弱,IL-1β的表达量减少。结论铜绿假单胞菌生物被膜菌可以逃逸巨噬细胞的免疫防御作用,其机制可能与降低巨噬细胞的炎症反应有关。

血清及转铁蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨血清及转铁蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。方法采用微孔板结合结晶紫染色半定量试验测定血清及转铁蛋白对表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制作用;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测血清中能与表皮葡萄球菌生物膜结合的有效成分;最后利用盖玻片和导尿管体外构建表皮葡萄球菌生物膜,分析转铁蛋白的生物膜抑制能力。结果 25%的血清能使表皮葡萄球菌生物膜的形成量(A570值)从0.71±0.13减少到0.20±0.08(t=5.75,P<0.05)。SDS-PAGE检测血清处理表皮葡萄球菌后25×103蛋白和(45~70)×103蛋白条带数量或表达量显著增多。当转铁蛋白浓度≥5.21mg/ml时,可显著抑制生物膜的形成(t=2.99,P<0.05),且随着浓度增高,其抑制能力增强。此外,5mg/ml的转铁蛋白还可显著抑制盖玻片和导尿管表面生物膜的形成。结论血清及其成分转铁蛋白可显著抑制表皮葡萄球菌生物膜形成。