一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因,利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明:该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株(HN-HB1-2018、HBHA2015)的核苷酸相似性为98.0%~98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%~90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.

H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

为构建H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒,研制新型基因工程疫苗。利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统,在Sf9细胞中共表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白。将H5亚型禽流感病毒的HA基因和M1基因分别克隆至pFastBac-dual载体PH和P10启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFastBac-H5-M1,再通过蓝白斑筛选获得重组杆粒,将重组杆粒转染至昆虫细胞Sf9中,拯救重组杆状病毒,通过间接免疫荧光、westernblot试验鉴定是否表达特异性蛋白,最后在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。重组H5亚型禽流感病毒HA基因和M1基因的杆状病毒,在Sf9细胞中盲传3代后,可在显微镜下观察到杆状病毒感染引起的细胞肿胀破裂等细胞病变;通过间接免疫荧光试验可观察到细胞内绿色荧光信号,证明重组杆状病毒拯救成功;westernblots试验结果显示Sf9细胞中可检测到HA蛋白和M1蛋白,目的条带大小分别为70ku和25ku左右,与预期相符,并且均以分泌上清的形式表达;通过透射电镜可在Sf9细胞上清中观察到与流感病毒结构类似的颗粒。本研究成功构建共表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白的重组杆状病毒,该重组杆状病毒可在Sf9昆虫细胞中组装成与天然流感病毒粒子结构相似的颗粒样物质。