人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 。

白介素-1α及与白介素-11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化

目的探讨细胞因子白介素-1α(IL-1α)及与白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)和胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)联合应用对体外诱导人神经干细胞定向分化为多巴胺神经元的影响。方法采用无血清培养技术和单细胞克隆技术、免疫荧光双标技术。结果对照组仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺神经元;IL-1α组分化的多巴胺神经元较多,但细胞形态欠成熟;联合因子组分化的多巴胺神经元最多,细胞较为成熟。结论IL-1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用,联合应用IL-1α、IL-11、LIF和GDNF对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用。

核受体相关因子1基因过表达诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元

目的探讨核受体相关因子1(Nurr1)基因对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法通过基因重组技术构建pEGFP-N1-Nurr1真核表达载体,用电穿孔法将重组质粒转染第3代NSCs,用荧光显微镜观察转染效率,免疫印迹法检测基因表达效果;并对转染后的NSCs进行体外分化培养3周,用免疫荧光双标技术检测酪氨酸羟化酶(TH)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果电穿孔法转染NSCs48h后转染效率达35%,1周后免疫印迹法检测到Nurr1蛋白高表达,约为对照组的5倍;Nurr1基因转染的NSCs分化为TH阳性神经元的比率为15.45%,明显高于对照组,而MAP-2阳性神经元数量与对照组相似。结论 Nurr1基因过表达可以诱导NSCs向TH阳性的多巴胺能神经元分化。

银杏内酯B体外诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化

目的：探讨银杏内酯B（GKB）对大鼠中脑神经干细胞（NSCs）体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法：采用无血清培养技术从大鼠胚胎中脑组织中分离培养出神经干细胞克隆球，然后分为2组诱导分化,对照组分化培养液中仅含10%FBS，银杏内酯B组在对照组分化培养液的基础上加入终浓度为40μg/ml的银杏内酯B。2周后免疫印迹检测分化的细胞中多巴胺能神经元发育和分化调节因子Nurr1蛋白的表达情况；免疫荧光检测分化神经元中酪氨酸羟化酶（TH）标记的多巴胺能神经元数量和分化情况。结果：对照组Nurr1蛋白相对表达量很低，仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺能神经元；银杏内酯B组Nurr1表达显著升高，分化的多巴胺能神经元较多，且细胞形态较成熟，突起较丰富。 结论：银杏内酯B具有诱导中脑NSCs向多巴胺能神经元分化的作用，其作用机制可能与上调Nurr1表达有关。

Brn4在神经干细胞向神经元分化中的作用及其机制研究

目的:观察脑因子4(Brn4)对神经干细胞(NSCs)向神经元分化的诱导作用,探讨Brn4促进新生神经元成熟和维持细胞存活的分子机制。方法:应用基因重组技术,构建pLV5-Brn4-GFP慢病毒表达载体,感染NSCs后使外源性Brn4基因稳定高表达。NSCs诱导分化后,应用细胞免疫荧光法检测NSCs分化为微管相关蛋白-2(MAP-2)阳性神经元的情况,应用TUNEL法检测分化细胞的凋亡情况。结果:重组病毒感染NSCs后,Brn4蛋白表达较对照组增高约5倍,同时分化细胞中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其受体GFRα-1和Ret蛋白的相对表达量均明显高于对照组(P﹤0.01)。NSCs分化2周后,Brn4过表达组MAP-2阳性神经元的分化率(65.71±5.18%)明显高于对照组(12.57±1.77%)(P﹤0.01),且细胞胞体较大,突起较丰富。而凋亡细胞的百分率(2.73±0.44%)明显低于对照组(8.39±0.95%,P﹤0.01)。结论:Brn4基因过表达可诱导NSCs向神经元分化,同时通过GDNF信号通路促进新生神经元的发育成熟,并通过抑制细胞凋亡提高细胞存活率。

PD模型大鼠黑质中Nurr1和TH的表达变化及其意义

为探讨孤儿核受体(Nurr1)在多巴胺能神经元损伤修复过程中对特异性表型酪氨酸羟化酶(TH)的影响,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠一侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病(PD)模型,分别应用Western blot和免疫组织化学技术观察不同时间点中脑黑质中Nurr1、TH蛋白表达的变化及其相关性。结果显示,Nurr1蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中即明显下降,7d后开始逐渐上升,14d接近正常水平,28d明显升高;TH蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中无明显变化,7d开始下降,14d达最低,28d开始上升。上述结果提示,在6-OHDA损伤黑质-纹状体通路后,Nurr1的表达先下降后上升,其表达变化早于TH,可能在PD模型大鼠的损伤修复中发挥重要作用。

Flash课件在心血管系统教学中的应用及效果评价

在计算机应用日益普及的大学课堂中,多媒体教学方式还是比较单一,主要是以传统Powerpoint（ppt）文档的形式开展理论教学,这对于人体解剖学心血管系统章节的讲解就显得较为局限。由于心血管系统的复杂性和相对抽象性,

人神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化

目的 :将体外扩增的神经干细胞在体外诱导向多巴胺能神经元分化 ,为帕金森氏病的细胞移植治疗奠定基础。方法 :利用无血清培养和单细胞克隆技术从 4月龄胚胎中脑组织获得神经干细胞 ,用 10 %胎牛血清 (FBS)、IL -1α以及IL -1α +IL -11+LIF+GDNF的组合诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化 ,用酪氨酸羟化酶 (TH)免疫检测分化为多巴胺神经元的情况。结果 :10 %FBS只能使极少数神经干细胞分化为TH阳性的多巴胺神经元 ;IL -1α可以诱导神经干细胞较多地分化为TH阳性多巴胺神经元 ,但细胞形态上不成熟 ;联合应用IL -1α、IL -11、LIF、GDNF后 ,分化的多巴胺神经元数量上和单用IL -1α相似 ,但细胞形态上比较成熟。结论 :联合应用IL -1α、IL -11、LIF、GDNF等细胞因子诱导人神经干细胞分化得到的TH阳性多巴胺神经元不但数量较多 。

壳聚糖支架与神经干细胞生物相容性的研究

为探讨壳聚糖多孔支架与神经干细胞(NSCs)的生物相容性,应用冷冻干燥技术制备壳聚糖多孔支架,将神经干细胞克隆球接种于壳聚糖支架载体上,分为NSCs+支架组和NSCs+支架+NGF组。培养2周后冰冻切片,行Nissl染色及微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)免疫组化染色来检测NSCs的分化,并进行MAP-2阳性细胞计数、胞体面积、细胞周长的图像处理和统计分析。结果显示:壳聚糖支架孔隙率为90%,支架孔径为50～350μm。NSCs可以在壳聚糖支架上存活、迁移并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs+支架+NGF组的MAP-2阳性细胞数明显多于NSCs+支架组,且胞体较大,突起较多且长。上述结果提示,壳聚糖支架与NSCs具有良好的生物相容性,外源性的NGF能够促进壳聚糖支架中的NSCs向神经元分化。

海马中56 kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用

在已证明切割海马伞海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用。取切割SD大鼠海马伞后14d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d和正常海马56kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析。结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组最好,正常组次之,而空白对照组最差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果。上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化。

海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用

为了探讨切割海马伞后的海马和正常海马在蛋白表达方面的差异,获取海马中具有生物活性的特异蛋白,并观察其对人胚神经干细胞迁移的影响,取切割SD大鼠海马伞后10、14、20d及正常海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d海马和正常海马的56kD差异蛋白胶条及空白对照胶条共培养,观察神经干细胞球中神经干细胞迁移情况,第3d时计数朝胶条方向1/4扇区内的迁出细胞数。结果显示,切割后各天组和正常组比较见多条差异蛋白条带,其中56kD差异蛋白的密度积分正常组最低,10d组和20d组较高,14d组最高。神经干细胞球中向56kD差异蛋白胶条方向迁移的细胞数在切割组最多,正常组次之,对照组最少。提示切割海马伞后的海马与正常海马间存在多种差异蛋白,其中56kD蛋白在切割海马伞后14d表达量最高,并具有诱导神经干细胞迁移的作用。

IL-1α及与IL-11、LIF和GDNF联合诱导胚鼠皮质、中脑神经干细胞向多巴胺神经元分化的比较

为比较皮质和中脑来源的神经干细胞(NSCs)定向分化为多巴胺神经元的情况,应用无血清和单克隆培养技术,分别从皮质和中脑组织中分离克隆、扩增NSCs,然后分成3组诱导分化:①对照组用10%胎牛血清诱导分化;②IL-1α组在10%胎牛血清的基础上加IL-1α诱导分化;③联合因子组在10%胎牛血清的基础上加IL-1α、IL-11、LIF及GDNF进行诱导分化。用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色检测多巴胺神经元。在100倍镜下随机取5个视野,计数每个视野中的TH阳性神经元数;并用图像分析软件处理TH阳性神经元的胞体面积和细胞周长;用STATA7.0统计软件进行统计处理。结果显示,皮质对照组中仅见极少的TH阳性神经元(0.25±0.163),中脑对照组中见少量TH阳性神经元(2±0.378);而皮质IL-1α组有较多的TH阳性神经元(15.5±0.866),中脑IL-1α组中的TH阳性神经元则为皮质IL-1α组的150%(22.875±1.517);皮质联合因子组中的TH阳性神经元数(25.75±0.940)与中脑联合因子组中的TH阳性神经元数(28.875±2.125)接近,无显著差异。胞体面积和细胞周长的结果显示出IL-1α组和联合因子组大于对照组、而联合因子组又优于IL-1α组的趋势。上述结果提示,中脑来源的NSCs本身具有一定的分化为多巴胺神经元的区域特异性,而皮质来源的NSCs在IL-1α、IL-11、LIF及GDNF等细胞因子的诱导下可改变其区域特异性而分化为较多较为成熟的多巴胺神经元。

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响。方法12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液,并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU。于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无。结论切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加NGF可促进其增殖和分化。

NOV蛋白在切割海马伞大鼠海马中表达的变化

通过切割右侧海马伞制备大鼠海马伞损伤模型,应用Westernblotting、免疫组织化学技术,观察切割海马伞后不同时程海马中肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)蛋白表达的变化,并对结果进行图像处理和统计学分析。Westernblotting结果显示,NOV蛋白在切割海马伞后3d表达开始上升,14d达高峰后缓慢下降。切割海马伞后14d切割侧和正常侧相比较,海马CA1-CA3区的锥体细胞层及齿状回颗粒层NOV阳性细胞数目无显著性差异(P>0.05),但切割侧NOV阳性细胞明显比正常侧深染,两侧比较平均灰度值有显著性差异(P<0.01)。结合本课题组以往的工作,本研究结果提示,切割海马伞后海马中高表达的NOV蛋白可能参与了诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的过程。

切割穹隆海马伞海马提取液促进放射状胶质细胞增殖和向神经元分化

目的探讨海马微环境的变化对体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化的影响。方法本实验在成功制备正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液的基础上,分别使用正常侧和切割侧海马提取液,观察其在体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化过程中所起的作用。结果在放射状胶质细胞增殖阶段,切割组与正常组及对照组相比,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的增殖细胞比例明显提高(P<0.05);在放射状胶质细胞分化阶段,切割组与正常组及对照组相比,Tuj1阳性神经元数量明显增多(P<0.05)。结论切割穹隆海马伞侧海马提取液对大鼠放射状胶质细胞的增殖和向神经元的分化有明显促进作用,提示海马微环境对海马放射状胶质细胞的增殖和分化有重要影响。

Brn-4抗体对大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备成年SD大鼠海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离、克隆和扩增的神经干细胞球分成6组:(1)切割组:加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(2)切割阻断组:在切割组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(3)正常组:加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(4)正常阻断组:在正常组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(5)空白组:加入单纯的DMEM/F12培养基;(6)空白阻断组:在空白组培养基中加入Brn-4多克隆抗体。培养后第14d对NSCs分化的神经元进行MAP-2免疫荧光检测,图像处理系统计数各组MAP-2阳性神经元数、处理胞体面积和细胞周长,STATA7.0软件进行统计分析。结果显示:各组以上三项形态学指标从优到劣的排列顺序为:切割组、正常组、切割阻断组、正常阻断组、空白组和空白阻断组。统计分析结果表明,除空白组与空白阻断组三项指标无显著性差异外,其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05)。上述结果提示,Brn-4多克隆抗体在体外能部分地阻断切割海马伞侧海马提取液促进NSCs向神经元分化的作用,因而Brn-4在海马NSCs向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物联合诱导海马NSCs向胆碱能神经元的分化

为探讨切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物(extract of ginkgo bilobo,EGb)在海马NSCs向胆碱能神经元定向分化中的作用,分别制备大鼠穹窿海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离扩增的NSCs球分成4组,应用不同的培养液促其分化:(1)联合组:含切割侧海马提取液和银杏内酯的DMEM/F12培养基;(2)提取液组:含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(3)EGb组:含银杏内酯的DMEM/F12培养基;(4)对照组:含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基。培养14d后行ChAT免疫荧光检测,计算ChAT阳性神经元的分化率,图像处理细胞面积和周长。结果显示联合组各项指标均明显优于其它各组(P<0.01);提取液组、EGb组各项指标也均优于对照组(P<0.05);细胞面积提取液组优于EGb组(P<0.05),细胞周长EGb组优于提取液组(P<0.05),两组ChAT阳性神经元分化率无明显差异(P>0.05)。上述提示切割穹窿海马伞的海马提取液和EGb联合应用可诱导海马NSCs分化为更多、更为成熟的胆碱能神经元。

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

共培养环境中大鼠胚胎中脑细胞诱导人脐带间充质干细胞分化

目的:检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)在与大鼠胚胎中脑细胞共培养环境中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)表达的变化。方法:(1)植块法分离培养hUCMSCs,以细胞免疫化学法鉴定其表面特异性标记物的表达;(2)无菌条件下分离E15大鼠胚胎中脑组织,制成单细胞悬液及中脑组织提取液;(3)用大鼠胚胎中脑组织提取液做培养液,将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的hUCMSCs与大鼠胚胎中脑细胞共培养14 d,细胞免疫化学法检测hUCMSCs中TH和DAT的表达。结果:HUCMSCs高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,极低表达CD31和CD45。在与大鼠胚胎中脑细胞共培养14 d后,hUCMSCs中TH阳性表达率为(18.06±2.29)%,DAT阳性表达率为(11.14±2.10)%。结论:用植块法可成功分离并体外培养hUCMSCs,其免疫表型符合间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的特征。在以大鼠胚胎中脑组织提取液作为培养液,并与大鼠胚胎中脑细胞共培养的诱导条件下,hUCMSCs可部分向多巴胺能神经元分化。