电针对阿尔茨海默病不同病理阶段自噬状态影响差异性研究

目的 观察电针对APP/PS1双转基因小鼠老年斑出现前后不同病理阶段自噬状态影响的差异性,从自噬角度探讨电针干预阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的作用机制。方法 4月龄和8月龄APP/PS1双转基因雄性小鼠各20只,随机分为模型组(4月龄和8月龄模型组)和电针组(4月龄和8月龄电针组),每组10只;以同月龄同性别C57BL/6野生型小鼠为正常组(4月龄和8月龄正常组)各10只。电针组取双侧涌泉穴直刺后接电针仪,百会穴平刺后单向滞针再留针,共20 min。干预隔日1次,共6周。采用Morris水迷宫实验评价小鼠空间学习记忆能力;通过免疫组化技术观察小鼠海马淀粉样斑块沉积情况;用免疫荧光技术观察小鼠海马LC3和β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)表达情况;用酶联免疫吸附法检测小鼠海马Aβ表达水平;用Western blot法检测小鼠海马自噬相关蛋白LC3和p62相对表达量。结果 Morris水迷宫结果显示,6月龄和10月龄模型组小鼠平均逃避潜伏期均较同月龄正常组增加(P<0.01),平台象限停留时间均减短(P<0.01);与6月龄和10月龄模型组相比,同月龄电针组小鼠平均逃避潜伏期均减少(P<0.05),平台象限停留时间均延长(P<0.01)。免疫组化结果显示,6月龄模型组海马区域可见少量老年斑,10月龄模型组海马区域可见大量老年斑。免疫荧光技术结果显示,LC3和Aβ阳性表达主要位于海马神经元核周,LC3阳性还表达在细胞突起中。酶联免疫吸附法检测结果显示,同月龄模型组海马Aβ水平均高于正常组(P<0.01);同月龄电针组海马Aβ水平均低于同月龄模型组(P<0.01);6月龄模型组海马Aβ水平明显低于10月龄模型组(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,与同月龄正常组比较,6月龄模型组LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达均降低(P<0.01);与同月龄模型组比较,电针组LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加(P<0.01),p62差异无统计学意义(P>0.05)。与同月龄正常组比较,10月龄模型组LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达均增加(P<0.01,P<0.05);与同月龄模型组比较,电针组LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达均降低(P<0.01,P<0.05)。结论6月龄和10月龄APP/PS1转基因鼠老年斑出现前后不同病理阶段的自噬状态不同。电针可提高6月龄APP/PS1双转基因鼠海马自噬功能,调节10月龄双转基因鼠自噬功能紊乱状态,电针改善不同病理阶段APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力,降低海马Aβ水平的机制存在差异性。

电针“百会”“涌泉”对6月龄APP/PS1双转基因小鼠行为学及海马Dynein、CTSD水平影响的研究

目的:从细胞内β-淀粉样蛋白(Aβ)及自噬溶酶体角度探讨电针干预阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法:将20只6月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为电针组和模型组;10只6月龄雄性C57BL/6野生小鼠作为空白对照组。电针组针刺“百会”“涌泉”穴,双“涌泉”连接电针,留针15 min/次;空白对照组和模型组小鼠用与电针组相同的方法束缚15 min/次。隔日1次,共治疗6周。利用Morris水迷宫检测小鼠空间学习和记忆能力;透射电镜观察小鼠海马自噬体、自噬溶酶体情况;免疫荧光双标法观察小鼠海马CA1区CTSD和Aβ的共表达情况;Western blot(WB)法检测小鼠海马内Dynein和CTSD的相对表达量。结果:Morris水迷宫检测结果显示,在定位航行实验中,与空白对照组比较,模型组小鼠平均逃避潜伏期增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠平均逃避潜伏期减少,差异有统计学意义(P<0.05)。在空间探索实验中,与空白对照组比较,模型组小鼠平均穿越平台次数减少,平台象限游泳路程减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,电针组小鼠平均穿越平台次数增加,平台象限游泳路程增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。透射电镜实验结果显示,空白对照组海马可观察到少量的自噬溶酶体;模型组海马有大量的自噬体堆积,主要是在神经元轴突末端,胞体核周可见许多自噬溶酶体;电针组海马神经元轴突中也可以观察到部分自噬体堆积,胞体核周可见部分自噬溶酶体。免疫荧光双标法结果显示,CTSD和Aβ在小鼠海马CA1区神经元内存在共表达。Western blot结果显示,与空白对照组比较,模型组动力蛋白中间链DIC表达量降低,CTSD表达量增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组动力蛋白中间链DIC表达量增加,CTSD表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:8月龄APP/PS1双转基因小鼠海马神经元自噬功能紊乱;电针可能通过调节小鼠紊乱自噬状态,促进自噬体运输及自噬溶酶体降解,改善AD小鼠的空间学习和记忆功能。

基于内体-溶酶体系统探讨电针“百会”“涌泉”改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的作用机制

目的:观察电针“百会”“涌泉”对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力、海马区β淀粉样蛋白沉积及相关蛋白表达的影响,从内体-溶酶体系统角度探讨电针改善阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法:将6月龄雄性APP/PS1转基因小鼠随机分为模型组和电针组,每组10只;另以10只6月龄雄性C57BL/6小鼠作为正常组。电针组针刺“百会”“涌泉”,双侧“涌泉”接电针,15 min/次;模型组和正常组在相同时间以相同方法束缚15 min/次。以上干预均隔日1次,共6周。以Morris水迷宫实验检测各组小鼠学习记忆能力,免疫组织化学法检测小鼠海马区老年斑(SP)的阳性表达,透射电镜观察小鼠海马神经元内体、溶酶体超微结构,Western blot法检测小鼠海马Ras相关蛋白5(Rab5)、Ras相关蛋白7(Rab7)、组织蛋白酶D(CTSD)等内体-溶酶体系统相关蛋白的表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.05,P<0.01),穿越原平台次数及原平台象限游泳路程均减少(P<0.05),海马区SP阳性表达增加(P<0.01),海马神经元胞体中内体、溶酶体堆积,海马组织Rab5、Rab7、CTSD蛋白表达水平均升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),穿越原平台次数及原平台象限游泳路程均增加(P<0.05),海马区SP阳性表达减少(P<0.01),海马神经元胞体中内体、溶酶体堆积减少,海马组织Rab5、Rab7、CTSD蛋白表达水平均降低(P<0.01)。结论:电针“百会”“涌泉”可改善AD小鼠学习记忆能力,减少海马区β淀粉样蛋白沉积,其机制可能与电针调控内体-溶酶体系统功能有关。

电针对阿尔茨海默病小鼠海马细胞内β-淀粉样蛋白及自噬相关蛋白表达的影响

目的:通过观察电针对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠海马细胞内β-淀粉样蛋白(Aβ)及自噬相关蛋白表达的影响,探讨电针治疗AD的机制。方法:将18只6月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组和电针组,每组9只;以9只同月龄同性别的C57BL/6野生型小鼠作为正常对照组。电针组小鼠给予针刺“百会”及电针双侧“涌泉”,20 min/次,隔日1次,共治疗21次。采用Morris水迷宫实验观察小鼠空间学习记忆能力,透射电镜法观察小鼠海马自噬相关病理变化,免疫荧光染色法观察小鼠海马CA1区微管相关蛋白1轻链3(LC3)及Aβ的表达,Western blot法检测小鼠海马组织中LC3、p62蛋白的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.01),原平台象限停留时间缩短(P<0.05),海马CA1区LC3、Aβ阳性表达均升高(P<0.01),海马组织中LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,电针组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),原平台象限停留时间延长(P<0.05),海马CA1区LC3、Aβ阳性表达均降低(P<0.05),海马组织中LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低(P<0.05)。透射电镜结果显示,正常对照组海马神经元结构正常,模型组海马神经细胞内存在大量自噬溶酶体,电针组仅观察到少量自噬溶酶体。结论:电针可降低APP/PS1双转基因小鼠自噬相关蛋白LC3与p62的表达水平,改善其海马自噬状态,减少细胞内Aβ聚集,从而改善其学习记忆能力。