温哥华假单胞菌菌株PAN4解磷能力及对核桃的促生作用

【目的】探讨温哥华假单胞菌Pseudomonas vancouverensis菌株PAN4解磷能力的动态变化及不同培养条件对菌株解磷能力的影响,及其对核桃Juglans sigllata苗的促生作用和光合特性的影响.【方法】利用Pikovskaya培养液[液体蒙金娜培养基(PVK)]研究温哥华假单胞菌溶磷特性,单因素试验测定碳源、氮源、初始培养液pH、温度对其解磷能力的影响,采用盆栽试验探究在灭菌土和未灭菌土中菌剂对核桃苗的促生效应.【结果和结论】随时间延长,温哥华假单胞菌菌株PAN4培养的离心上清液中,有效磷含量显著增加,48 h时达到峰值;麦芽糖、玉米浆分别为最适碳源、氮源;pH7、温度28℃时,菌体生长量最大,解磷能力最强,二者呈显著正相关关系.不同浓度菌剂均可使核桃苗的株高、地径、净光合速率、呼吸速率和叶绿素含量不同程度地增加,浓度越高增幅越大;施复合肥的效果不如108和109cfu·m L-1的菌剂;菌剂在非灭菌土中的促生效果比灭菌土好.

铜绿假单胞菌发酵条件优化及抗菌物质研究

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其代谢产物对撑×绿杂交竹梢枯病病原菌暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum(Corda)M.B.Elli)具有较好的拮抗作用。采用单因素试验和正交试验对铜绿假单胞菌的培养基和发酵条件进行优化,并对其产生的抑菌活性物质的特性进行了初步研究。结果显示:优化培养基配方为蔗糖5 g,蛋白胨10 g,氯化钠2.5 g,水1 000 mL;最佳发酵条件为温度25℃,初始pH7.5,接种量1 mL,瓶装量150 mL于300 mL三角瓶中,发酵时间60 h。粗活性物质检测试验表明:其分子质量小于1 000 u;代谢产物中大分子蛋白质的生物活性远远低于小分子非蛋白成分;该菌粗提物中具有生物活性的成分大多是极性较小的物质,且在有机溶剂中溶解性较好,三氯甲烷为最佳萃取剂。

解淀粉芽孢杆菌在山茶叶中的定殖及对山茶灰斑病的防效

【目的】解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是从山茶叶片内部分离得到的1株内生拮抗菌株,通过研究该菌株在山茶叶片表面和内部的定殖规律及其对山茶灰斑病的田间防治效果,为新型生防制剂的开发及山茶灰斑病的生物防治提供理论依据。【方法】采用抗生素标记法,结合比较标记菌株和非标记菌株的形态特征、拮抗能力、防病效果,筛选出最佳标记菌株;分别采用喷施和针刺法研究接种浓度、病原菌对生防菌在山茶叶表面及内部定殖动态的影响,并测定生防菌对山茶灰斑病的田间防治效果。【结果】从含500μg/mL链霉素抗性平板上得到最佳标记菌株,标记菌株与未标记菌株在形态特征、拮抗能力、防病效果方面均无明显差异。定殖试验表明,解淀粉芽孢杆菌能够高效定殖于山茶叶表面及内部,且叶表面的定殖较叶片内部更为高效、持久,其定殖量与接种浓度呈正相关,并在一定时间内维持相当数量,病原菌仅与叶表面定殖密切相关,与生防菌的叶内定殖无关。田间防治试验表明,生防菌解淀粉芽孢杆菌菌悬液对山茶灰斑病有显著生防效果,预先接种生防菌菌悬液后再接种病原菌的生防效果最好,防效为75.35%,先接种病原菌后喷施解淀粉芽孢杆菌菌悬液处理的防效为73.89%,同时接种生防菌菌悬液和病原菌时的防效最低,为72.95%。【结论】生防菌株B.amyloliquefaciens能够有效定殖于山茶叶片表面及内部,且对山茶灰斑病具有显著的生物防治效果。

铜绿假单胞菌与长枝木霉对杂交竹梢枯病的协同增效生防研究

铜绿假单胞菌和长枝木霉均对杂交竹梢枯病菌具有明显的拮抗作用。通过室内抗生素、紫外诱变和杀菌剂胁迫培养,获得铜绿假单胞菌和长枝木霉突变菌株,此突变体在形态特征、平板抑菌活性上与原始菌株差异不显著,且具有长期稳定的抗药性。田间喷施突变菌株菌悬液或孢子悬液可以使其成功定殖到杂交竹叶表面。铜绿假单胞菌和长枝木霉的亲和性研究显示,二者浓度低于108cfum L,均无明显抑制作用,具有高度亲和性,这有利于2菌株在杂交竹梢枯病生物防治中协同作用的发挥。利用铜绿假单胞菌悬液和长枝木霉孢悬液进行梢枯病菌田间协同防治试验,结果表明:预先接种拮抗菌防效最高,其次是同时接种,后施拮抗菌防效最低,说明铜绿假单胞菌和长枝木霉均有良好的防病作用。另外,2菌株的联合使用在3种处理中防效均最优,尤其是在先接种病原菌的处理中,协同防效得到很大提高,说明二者联合使用有良好的梢枯病治理作用。

南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定

经形态学特征观察、致病性测定及rDNA-ITS序列分析,首次确定红豆杉根腐病病原为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。采用平板对峙培养法从健康植株根际土壤中筛选得到3株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的芽胞杆菌YB6、YB15、YB37。经形态学、生理生化及16SrDNA同源性分析,并通过构建16SrDNA系统发育树,将YB6、YB15和YB37分别鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)和多黏类芽胞杆菌(Paenibacillu polymyxa),其中多黏类芽胞杆菌拮抗效果最好,具有进一步研究开发的潜力。本研究通过对南方红豆杉根腐病病原鉴定及其拮抗芽胞杆菌的筛选,对该病的防治提供了理论依据。

核桃细菌性黑斑病杀菌剂筛选及药效研究

本文以黄单胞杆菌Xanthomonas campestris pv.juglandis(Pierce Dowson)为供试菌株,选用不同浓度的13种杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明:有10种药剂对该菌有一定的抑制效果,但只有5种杀菌剂能够产生明显的抑菌圈。其中,四霉素和链霉素的抑菌效果最强,最低抑菌浓度为0.165、3μg/mL,抑菌率为74.76%、69.23%,EC 50为12.764、35.318μg/mL。其他依次为乙蒜素、中生菌素和春雷霉素。选用这5种杀菌剂进行盆栽防治试验,四霉素和链霉素的平均防效达74.60%、71.69%,乙蒜素和中生菌素防效分别为65.98%、58.40%,春雷霉素防效最低为39.38%。其结果与室内基本一致。室内试验及盆栽试验结果表明四霉素、链霉素、乙蒜素、中生菌素和春雷霉素可作为防治核桃黑斑病的杀菌剂,其中四霉素为首选杀菌剂。

双基因联合PCR检测水稻叶鞘网斑病菌

[目的]建立水稻叶鞘网斑病的快速PCR检测体系,为该病害的早期诊断提供技术支持。[方法]以水稻叶鞘网斑病病原菌帚梗柱孢霉(Cylindrocladium scoparium Morgan)DNA为模板,分别以factor 1-α(tef1)和β-tubulin gene两个保守性极强的特定区域序列作为检测靶标,针对C.scoparium设计了EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9两对特异性引物,建立了水稻叶鞘网斑病的双基因联合PCR检测技术。[结果]该体系的最佳退火温度为58℃,DNA灵敏度检测限达到550 fg·μL-1,病原菌可扩增出大小分别为272 bp和157 bp的2条条带,而其他对照组均未有扩增条带。[结论]田间时效检测结果显示:该体系能准确检测出不同发病地区的水稻叶鞘网斑病病原菌,为农业生产早期诊断水稻叶鞘网斑病害提供技术支持。

坚强芽孢杆菌的筛选及抗菌活性

采用兰层琼脂法初选对枯斑盘多毛孢Pestalotia funerea有抗生作用的细菌苗株共10株，4株Pseudomonas spp．对枯斑盘多毛孢的抗生作用小于6株Bacillus spp．；在Bacillus spp．中，以B5菌株拮抗带最大，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌Bacillus firmus．对峙培养显示B5对枯斑盘多毛孢有明显的抑菌圈（平均6mm）；B5产生的非挥发性物质对枯斑盘多毛孢菌落的抑制总的表现为稀释度越小，菌落直径生长越小．抑制作用越大，抑制中量为1：1000～1：10000；B5产生的多糖、粗脂肪、蛋白质对枯斑盘多毛孢孢子萌发有抑制作用，粗脂肪可完全抑制枯斑盘多毛孢的孢子萌发（抑制率为100％）．多糖在24h可完全抑制孢于萌发，蛋白质相对较差，48～72h抑制率为85％左右．

桉树焦枯病菌巢式聚合酶链反应快速检测方法的建立与应用

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。

绿粘帚霉(Gliocladium virens)厚垣孢子的生物学特性

主要研究绿粘帚霉厚垣孢子的诱导因素及其生物学特性。营养条件和生态因子试验表明。PD为绿粘帚霉产厚垣孢子的最佳培养基，厚垣孢子产生的最适培养条件为：光照、振荡、pH3、30℃，在此条件下可完全抑制其分生孢子的产生，并在1周内可产生厚垣孢子8．00×10^6个/mL；厚垣孢子萌发试验显示，25℃、pH为6～8为绿粘帚霉厚垣孢子的最佳萌发条件，48h时可达90％以上的萌发率，在5℃下贮存比较适宜。

绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌对松赤枯病的协同生物控制

G．virens与B．firmus对松赤枯病的协同控制显示：（1）预先接种病原菌后（7天）再进行生物防治处理，防治效果在处理间差异不明显，浓度影响无显著差异，即使是两种生防制剂联合使用也未显著提高其防效，但不同树种间的感病性有明显差异；（2）颉抗菌与病原菌同时接种，对松赤桔病有一定防治效果，两菌联合有一定的协同作用。两种菌单独施用防效差异不显著，浓度变化对防效影响不大；（3）预先接种颉抗菌能显著提高防治效果，两种菌联合处理防效更优，感病树种（马尾松、云南松、油松）的感病指数可降至13～15，抗病树种的感病指数可控制在3％左右；在同一浓度下B．firmus与G．virens间无显著差异，在同一颉抗菌下，浓度愈高，防效愈高；（4）三种生防接种方式的平均效果分析表明，G．virens最高平均防效49．5％（黑松），B．firmus为50％（辐射松），两菌联合最高平均防效80％（辐射松）；在同一树种条件下，“预先接种颉抗菌”的方式显著高于“颊抗菌与病原菌同时接种”和“预先接种病原菌”，而“颉抗菌与病原茼同时接种”的方式也明显优于“预先接种病原菌”。从防治效果的绝对值来看，“预先接种病原菌”方式在实际生产中表现为病害已发生再进行生防菌处理，这种情况对松赤桔病的控制无实际意义。

碳源和氮源对绿粘帚霉合成几丁质酶的影响

几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源,几丁质酶在降解几丁质方面有重要功能,而且在植病防治方面有重要作用。绿粘帚霉(G.virens)是生物防治中具有前途的拮抗菌。本文以胶体几丁质、细粉几丁质、葡萄糖、蔗糖为不同碳源,以KNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母浸粉为不同氮源对绿粘帚霉F051合成几丁质酶进行初步研究,发现绿粘帚霉F051合成几丁质酶的最佳碳源和氮源分别是细粉几丁质和酵母浸粉。

绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌的亲和性研究

绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌的亲合性研究显示,绿粘帚霉发酵滤液在70%浓度以下对坚强芽孢杆菌的生长繁殖无明显抑制作用,在70%以上浓度,坚强芽孢杆菌的生物量有所下降;而坚强芽孢杆菌发酵滤液对绿粘帚霉的生长繁殖无明显抑制作用。这种状况有利于二者在植物病害生物防治中协同作用的发挥,表明了两种微生物在松赤枯病生物防治中联合作用的可能性。

以思想政治教育促进西部高层次农业人才的培养

西部大开发,人才是关键,作为地处西部的农业高校,在研究生教育中必须加强思想政治教育,帮助研究生树立正确的世界观、人生观、价值观,了解国情、民情,培养全面发展的高层次农业科技专门人才,才能在西部的农业科技发展中拓展自己的空间和舞台,并为西部农业实现追赶式、跨越式发展作出贡献。

四川桉树内生菌根真菌的研究

四川省桉树内生菌根资源菌较丰富 ,共 14种 ,隶属接合菌亚门内囊霉科的 3个属。其中以球囊霉属(Glomus)的近明球囊霉 (G .claroideumSchenckandSmith) ,缩球囊霉 (G .constrictumTrappe) ,地表球囊霉 (G .ver siforme(Karsren)Berch) ,摩西球囊霉 (G .mosseae) ,有较广泛的宿主 ,为优势菌群 ,小果球囊霉 ,大果球囊霉 ,微丛球囊霉为零星出现 ,感染宿主相对较窄。通过 5种桉树固定标准地的调查 ,我们发现不同桉树树种内生菌化率有显著差异 。

花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果

【目的】对花椒根腐病生防芽孢杆菌进行分离、筛选、定殖和防效评价,为开发高效、稳定、持久的生物农药提供理论与实践基础。【方法】采用稀释平板涂布法分离健康花椒根际土中的芽孢杆菌,利用点菌法和打孔法2次筛选拮抗效果最佳的芽孢杆菌,根据形态特征和生理生化试验对其进行初步鉴定,并测定其对1年生花椒根腐病的防治效果。用链霉素标记拮抗芽孢杆菌,并检测该菌在花椒根际及根内土壤中的定殖动态,以此为基础,运用灌根法对花椒根腐病进行预防和治疗处理,计算发病率、病情指数和防治效果。【结果】在分离获得的20株芽孢杆菌中,编号为B3的菌株拮抗作用最强,抑菌圈直径达26.0mm,高温处理后仍具有活性,初步确定其为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。盆栽试验结果表明,花椒根腐病发病率和病情指数随B3菌株发酵液稀释倍数增加而增加,B3发酵液原液至稀释200倍以下防治效果显著。定殖动态试验结果表明,无论病原菌存在与否,抗300μg/mL链霉素的突变菌株均能在根际土壤和根内定殖,但根际土菌量大于根内,且早于根内达到峰值,随接种时间延长,定殖量下降并维持稳定。田间试验中,突变菌株B3无论预防还是治疗试验,均能发挥很好的效果,并优于原始菌株和化学农药双效灵。【结论】菌株B3能在花椒根际和根内很好地定殖、排挤病原物,具有对花椒根腐病进行生物防治的潜力和良好的发展前景。

水杨酸诱导山茶抗灰斑病的作用及生理生化响应

采用载玻片萌发法测定水杨酸(SA)对山茶灰斑病菌的影响。浓度为0～5mmol.L-1的SA对山茶灰斑病菌的孢子萌发没有抑制作用,其诱发抗病性可持续10～15天,诱导最佳间隔期为3天。用SA喷雾涂布叶片诱导山茶抗性,植株内丙二醛、木质素、可溶性蛋白含量等生化指标对山茶灰斑病菌诱导信号有不同响应。MDA含量在一定时间范围内减少,膜脂的过氧化程度降低,但随着处理时间的延长,这种诱导抗性的作用逐渐减弱,且在不同浓度处理间存在差异,在诱导并挑战接种的处理中,各处理表现为初期低于对照、后期缓慢上升;诱导并挑战接种的处理中,木质素含量的变化趋势与只诱导处理基本相似,高浓度诱导的木质素积累量大于低浓度;诱导并挑战接种处理的可溶性蛋白含量与只诱导处理也表现出相同的变化规律,诱导并挑战接种处理的可溶性蛋白含量比只诱导的处理和对照高。生化反应与病情指数的相关性分析表明:MDA、木质素含量与病情指数达到显著水平(P<0.05)。

利用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌ZJ20发酵参数

【目的】优化贝莱斯芽孢杆菌的培养条件,以提高其菌落数和抗菌活性,为该菌株工业化生产提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌ZJ20为供试菌株,采用单因素试验,研究培养基、pH、温度、转速对ZJ20菌落数和抗菌活性的影响;在此基础上,以菌落数为考察指标,采用响应面法对pH、温度、转速3个因素进行进一步的优化,得到了贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的最佳培养条件;最后在温室采用盆栽试验,研究最佳培养条件得到的贝莱斯芽孢杆菌ZJ20对杂交竹梢枯病的防治效果。【结果】单因素试验结果显示,供试培养基中,NB培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH 7.0～7.2)上贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均最高,分别为4.11×108 CFU/mL和6.10mm,且显著高于其余培养基,说明NB培养基更有利于贝莱斯芽孢杆菌的生长。当pH为4～10时,随着pH的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当pH为7～8时ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均显著高于其他处理;在此基础上的复筛结果显示,7.0～7.4为贝莱斯芽孢杆菌的最优pH。当转速为140～200r/min时,随着转速的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当转速为160～180r/min时,菌落数和抑菌圈直径均较高。温度为22～30℃时,随着温度的升高,菌落数和抑菌圈直径均先增加后下降,其中当温度为22～28℃时菌落数和抑菌圈直径均较高。响应面试验结果显示,3个因素中,转速对菌落生长和繁殖的影响最大,其次是温度,影响最小的是pH,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20最优培养条件为:pH 7.27,转速160r/min,温度28℃,在此条件下测定的菌落数为769×107 CFU/mL。盆栽试验结果显示,优化培养条件下得到的ZJ20悬液防治效果明显提高,均超过50%。【结论】得到了贝莱斯芽孢杆菌的最佳培养条件,这不仅使其菌落数增加,而且极大地增强了该菌的抗病活性。

杂交竹梢枯病菌拮抗细菌筛选及其抗菌物质研究

本文以杂交竹梢枯病菌Arthrinium phaeospermum为生防目标,从健康杂交竹上筛选拮抗细菌,并对其发酵条件及抗菌物质进行了研究。结果表明,分离所得88株细菌中菌株ZB27对暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum有较好拮抗作用,平均抑制率达75.52%。形态学、生理生化特征和16S rDNA分析将其鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。根据正交试验方差分析得出优化培养基配方为:牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖1g,(NH4)2SO40.05g,蒸馏水1000ml;最优发酵条件为:25℃,pH7.5,接种量1ml且装液量50ml于300ml三角瓶。其产生的抗菌物质具有耐热、耐酸碱、耐紫外、对氯仿不敏感等特点。

板栗铁型超氧化物歧化酶基因(CmFeSOD)的克隆及原核表达

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铁型超氧化物歧化酶(FeSOD)作为该酶系中的关键酶之一,与植物的抗病性关系密切。根据板栗(Castanea mollissimaBl)转录组数据中分析得到FeSOD基因EST序列设计PCR扩增引物,以板栗幼叶的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得CmFeSOD基因cDNA序列,通过生物信息学方法分析该基因的cDNA序列,并推定其氨基酸序列,同时将该基因片段连接到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行不同条件的诱导表达。结果表明,板栗CmFeSOD基因开放阅读框(ORF)大小为705bp,共编码234个氨基酸,推测其蛋白分子质量为26.0165ku,理论等电点(pI)为6.86,具有FeSOD家族的特征基序和保守结构域,GenBank登录号为KY312852。遗传进化分析表明,板栗CmFeSOD与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,通过原核表达获得CmFeSOD蛋白的分子质量约为29ku,CmFeSOD蛋白在30℃,添加0.4mmol/LIPTG,诱导6h表达量最高,主要以包涵体的形式存在。