应用电子显微镜技术对CAA和IBDV混合感染的研究

应用电子显微镜技术在鸡传染性法氏囊病(IBD)的自然病例中见到了大量的IBDV和一种较小的病毒粒子。这种小病毒粒子直径大约19nm,球形,无囊膜。免疫电镜的结果表明这种小病毒粒子是鸡贫血因子(CAA)。实验感染的SPF鸡表现出了与自然病例相似的临床症状、病理变化以及高死亡率,并且又重新分离到CAA和IBDV。除了这两种病毒之外,没有发现其它病毒。笔者认为混合感染,特别是与CAA的双重感染是高死亡率的IBD的重要原因。

三种动物慢病毒形态及形态发生的比较研究

用电镜检查确定了不同感染时间的马传染性贫血病毒 (EIAV)、维斯纳 梅迪病毒 (MVV)和山羊关节炎脑炎病毒 (CAEV)的形态和形态发生。成熟的病毒粒子为电子致密的球形 ,有囊膜 ,直径约 10 0nm ,含有 1个 (有时有 2个或 2个以上 )的核芯。维斯纳 梅迪病毒和山羊关节炎脑炎病毒的核芯为球形 ,马传染性贫血病毒为杆形或锥形。在大部分病毒里能清晰地看到核芯壳 ,成熟的病毒从感染细胞的胞浆膜上出芽 。

用TEM和SEM对肠毒性大肠杆菌超微结构及其定居状态的观察

产肠毒性大肠杆菌以其密集的纤毛实现了它与宿主小肠上皮细胞微绒毛的牢固粘附。用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)可把这种状态清晰地显现出来。该菌菌体长约200nm,菌壁厚约10nm,为周身性纤毛。纤毛的长短以及菌体定居状态因菌株的不同而有所差异。

猪流感病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从我国东北地区猪群中分离出 3株H3 N2 猪流感病毒 (SIV) ,分别命名为A/Swine/Heilongjiang/ 1/ 2 0 0 0、A/Swine/Heilogjiang/ 2 / 2 0 0 0和A/Swine/Heilogjiang/ 3/ 2 0 0 0。SIV分离株第 8代病毒液对 0 .5 %豚鼠红血球的血凝价分别为2 0 48log2 、2 0 48log2 、40 96log2 ;将其制成琼扩 (AGP)抗原与禽流感标准阳性血清均出现清晰白色沉淀线 ;与流感病毒H3 亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价分别为 8log2 、7log2 、7log2 ,但不能被鸡新城疫阳性血清抑制。这 3株SIV都为热不稳定型 ;均能凝集驴、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、人O型血红血球 ,对马、牛红血球均不凝集 ;感染一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间分别为 86 .4、12 9.6和 91.2小时 ;每 0 .2ml病毒液鸡胚半数感染量分别为 4.75lg、4.5lg、和 6 .0lg ;对鸡的静脉内接种致病指数和脑内接种致病指数各为 0 .5 6、0 .32、0 .5 2和 0 .77、0 .38、0 .5 2 ;对小鼠的半数致死量分别为 2 .6lg、2 .0lg和 2 .5lg ;试验感染小鼠、豚鼠和猪均可发病并出现死亡。存活动物接种后第 6天和第 14天的血清 ,其HI价均在 8log2 以上 ,而AGP均为阴性。

猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定

从临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)淋巴组织病料,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪圆环病毒2型(PCV2)感染,采用无污染的猪肾细胞系(PK15)分离培养,并连续传代培育成一株细胞培养适应毒,命名为PCV2/LG株。分离毒株经细胞培养,于第25代后毒价显著升高,于第35代毒价可达105.6TCID50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明,分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中;病毒感染的阳性细胞呈散在分布,阳性细胞数可达50%以上;免疫电镜观察到与PCV2特异抗体结合形成的病毒免疫复合物呈实心小颗粒样粒子团,病毒粒子直径约为17nm;病毒抗原基因组由1768个核苷酸组成,与GenBank登录的8个PCV2基因组序列同源性达96.2%以上。用2mL的病毒细胞培养物(105.6TCID50/mL)接种30日龄PCV2抗体阴性仔猪3头,可引起典型PMWS临床症状。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。

禽肺病毒的分离鉴定

禽肺病毒（ＡＰＶ）于１９７８年首次发现于南非，可引起火鸡鼻气管炎和鸡肿头综合症，至今未见其在中国存在的报道。我们从黑龙江省某肉种鸡场患肿头综合症的鸡中分离到了１株病毒。经鉴定，该病毒分离株缺乏血凝活性，具有典型的副粘病毒形态特征，可诱导特异性抗ＡＰＶ抗体的产生。因此可认定该病毒为１个ＡＰＶ分离株（命名为ＡＰＶ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｃｈｉｎａ／１／９８）。

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从１９９７年在辽宁省大连市某鸡场发生的一种以腺胃肿大为特征的鸡的传染病病例中收集腺胃组织（Ｄ９７１）接种ＳＰＦ鸡胚，传至１３代，具有规律性死亡和典型胚胎病变特征，ＥＩＤ５０为１０－６．４８／０．２ｍｌ。Ｄ９７１毒株感染ＳＰＦ鸡胚尿囊液经负染电镜观察，可见直径为８０～１２０ｎｍ，有囊膜和纤突的冠状病毒粒子。Ｄ９７１毒株经卵磷脂酶Ｃ处理后能凝集鸡红细胞，并能特异的被Ｄ９７１多抗所抑制。用反转录聚合酶链反应获得了Ｄ９７１毒株免原（Ｓ１）基因ｃＤＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳可见１．７ｋｂ的特征性条带。用Ｄ９７１毒株接种ＳＰＦ鸡，能引起与自然病例相似的病理变化，并分离到病毒。用Ｄ９７１毒株可直接感染ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞。结果证实从腺胃病变型ＩＢ鸡群中分离的Ｄ９７１毒株是冠状病毒科ＩＢＶ成员。

猪繁殖与呼吸综合征病毒形态学特征

应用电镜和免疫金电镜技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒的中国分离株进行了形态学研究。该病毒粒子直径约 5 5nm ,多数呈球形 ,有囊膜 ,但在其囊膜上没有发现纤突结构。在病毒粒子中央部可观察到拟核 (核衣壳 ) ,其直径约为 4 0nm。在宿主细胞浆的空泡膜及滑面内质网小池膜上“出芽” ,成熟的病毒粒子多蓄积在空泡腔内。病毒增殖数量与其适应宿主细胞程度有密切关系。

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株(IBV-D971)对SPF鸡的致病力试验

用腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株 Ｉ Ｂ Ｖ Ｄ９７１ 毒株接种１ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ 鸡， 可引起６０ ％ 死亡。该毒在 Ｓ Ｐ Ｆ 鸡体传２ 代后， 接种１ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ 鸡， 可引起１００ ％ 死亡。对人工感染病例进行了系统的病理学观察， 主要的眼观病理变化为腺胃胃壁增厚、乳头消失或乳头扁平， 乳头顶部凹陷坏死， 肾肿大、尿酸盐沉积。主要的组织学变化为腺胃粘膜上皮坏死脱落、固有层水肿、有炎性细胞浸润、肌层有淋巴细胞浸润、肌细胞坏死、腺小叶腺细胞坏死、核浓缩。小肠粘膜绒毛上皮增生、呈复层结构、固有层水肿、有大量淋巴细胞浸润。肾间质水肿、细尿管和肾小球间质内有淋巴细胞浸润。肝、心等实质细胞变性， 以至局灶性坏死。脾、胸腺及法氏囊的淋巴组织萎缩等， 人工感染鸡病例和自然发病鸡的病理变化基本相同。

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 。

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用反转录_聚合酶链式反应 (ReverseTranscription_polymeraseChainReaction ,PT_PCR)技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)中国地方分离株的核蛋白基因 ,并对其序列进行了测定 ,结果表明该病毒株核蛋白基因长度为 12 3 0bp ,编码蛋白由4 0 9个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较 ,发现与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。在此基础上 ,本实验构建了杆状病毒重组转移载体pBlue_N ,将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经过三轮蚀斑纯化和PCR鉴定 ,获得重组杆状病毒rBac_N。SDS_PAGE分析和Westernblot检测的结果表明核蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞内获得表达 ,融合蛋白表达量占细胞蛋白总量的 19.4

鸡传染性法氏囊病超强毒毒株的分离和初步鉴定

从死亡率高达55％的鸡传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群的病例中分离到一株IBD强毒。该强毒可使人工发病鸡36小时发病,发病率100％,死亡率60％。剖检可见到与野外病例相同的病理变化,如肌肉、心脏、腺胃出血,法氏囊呈“紫葡萄”样外观。免疫保护性试验、血清学试验、鸡胚接种和电镜形态学观察均证明该分离物为IBD病毒。并排除了新城疫和大肠杆菌混合感染,从而表明,我国鸡群中存在不同于经典IBD病毒的超强毒变异株。

快速检测动物病毒电镜技术

经多年研究，提出了适用于快速检出和鉴定动物病毒的系列电镜样品制备技术。该技术包括离子交换捕捉、微波幅射、高速离心、免疫金标方法。通过与常规法对比试验证实了离子交换捕捉法具有防腐保鲜作用，其浓缩样品的程度相当于超速离心法，简便易行，适用于远距离运送样品的检测；微波幅射改进法，不但加快了包埋制样速度，而且也提高了包埋质量；高速离心沉淀法快速简便，提高了检出率；免疫金标法不但提高了检出率，而且对于非典型及形态特征性不强的病毒粒子也能作出准确的诊断。可根据不同种类、不同目的的样品采取不同的制样方法，形成了系列化技术。此技术经农牧区、边疆、兽医生药厂、高等院校、科研单位以及海关进出口检疫等送检样品的验证，完全是可行的。应用该技术可快速、准确地诊断动物病毒病。

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ， 经免疫电镜观察纯化病毒， 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上， 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ，１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ， 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别， 这与国外的同类报道很相似。

我国鸡传染性支气管炎病毒LD3/01/07的分离鉴定

将我国黑龙江省某鸡场发病症状及病理变化疑似鸡传染性支气管炎的濒死病鸡肾脏组织加PBS缓冲液后研磨 ,- 70℃ / 37℃反复冻融三次 ,离心并进行无菌过滤后接种 10日龄SPF鸡胚。 72小时取尿囊液进行电镜观察并用 1%胰酶处理 ,观察对鸡红细胞的凝集情况。结果发现尿囊液中存在典型的冠状病毒粒子 ,而且用胰酶处理过的尿囊液能够凝集SPF鸡的红细胞 ,初步鉴定为鸡的传染性支气管炎病毒 (InfectiousBronchitisVirus ,IBV)。将该病毒尿囊液在 10日龄SPF鸡胚上连续传 8代 ,通过病毒对鸡胚的致病作用、病毒在电镜下的形态特征、病毒在鸡胚中的增殖动态以及病毒凝集鸡红细胞的特性等对该毒株进行研究。结果表明 :该毒株的第一代尿囊液中病毒的滴度很高 ,可达到 8log2 ,且胚体表现轻度出血 ,但实质器官未见肉眼可见的病变 ;第二代病毒即可致胚体严重病变 ;病毒在鸡胚中随着接种病毒后时间的延长 ,其滴度逐渐增高 ;经 1%胰酶处理后的各代病毒尿囊液可凝集鸡红细胞。鸡胚的第三代病毒尿囊液 (命名为LD3/ 0 1/0 7)分别接种 1日龄和 30日龄的SPF鸡 ,发现对不同日龄的鸡表现不同的致病性 ,对 1日龄接种鸡和同笼饲养的对照鸡致病力高 ,发病率和致死率均为 10 0 % ,(接种和同居感染各 4只 ,均死亡 ) ,30日龄接种和同居感?

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒强毒株的培育

用腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株 IBV-D971株接种 1日龄 SPF鸡 ,连续传 1 0代后 ,培育出了腺胃病变型鸡传染性支气管炎强毒株 IBV-D971 J株。 IBV-D971 J1 0 对 SPF鸡胚的致病力为 1 0 - 6 .45ELD5 0 /0 .2 m L,对 1日龄 SPF鸡的致病力为 1 0 - 1 .5 LD5 0 /1 m L。从死亡鸡的心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃、法氏囊等均能分离到 IBV,IBV-D971 J1 0 不含鸡新城疫、禽流感、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊炎、网状内皮组织增殖病等外源病毒。对 SPF鸡可引起典型的腺胃炎、肌胃炎。

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT_PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)DB株的核蛋白基因 ,并对其序列进行了测定 ,DB株IBV的核蛋白基因长度为 12 30bp ,编码蛋白由 4 0 9个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较 ,发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue_DB_N ,将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经过 3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应 (PCR)鉴定 ,获得重组杆状病毒rBac_DB_N。SDS_PAGE分析和Westernblot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞内获得表达 ,融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19 .4