血管紧张素Ⅱ促进心脏成纤维细胞转分化的实验条件优化

目的:评估和优化血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心脏成纤维细胞(CFs)转分化模型的实验条件。方法:分别分离培养成年和新生C57BL/6小鼠的CFs,在完全培养液中培养至不同代数(P1~P4);无血清培养4 h后,更换为含不同浓度(0%、2%和5%)胎牛血清(FBS)的培养液,并给予AngⅡ(10-6mol/L)刺激不同时间(24和48 h)后,收集细胞样品;通过Western blot、细胞免疫荧光和qPCR技术检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)和纤连蛋白(FN)的表达水平,以评估CFs的转分化情况。结果:(1)培养代数:在培养不同代数的成年和新生小鼠CFs中,只有P1 CFs在AngⅡ刺激48 h后(无血清),α-SMA、Col I和FN的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05);(2)AngⅡ刺激时间:AngⅡ刺激24和48 h,无血清培养的成年小鼠P1 CFs中α-SMA、Col I和FN的mRNA和蛋白水平均显著上升(P<0.05);P1新生小鼠CFs在无血清培养时,AngⅡ刺激48 h后细胞中α-SMA、Col I和FN的mRNA和蛋白水平均显著上升(P<0.05);(3)培养液血清浓度:AngⅡ刺激48 h后,P1成年/新生小鼠CFs在含0%和2%FBS的培养液条件下,α-SMA、Col I和FN的mRNA和蛋白水平显著上升(P<0.05)。结论:在含0%或2%FBS的培养液中,利用AngⅡ刺激24或48 h可以促进P1成年小鼠CFs出现显著的转分化,利用AngⅡ刺激48 h可以促进P1新生小鼠CFs出现显著的转分化。以上条件可作为细胞模型中研究CFs转分化较优的实验条件。

异丙基肾上腺素诱导小鼠心脏成纤维细胞转分化的特征

目的 探讨异丙基肾上腺素(ISO)诱导原代成年C57小鼠心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的特征。方法 应用胶原酶法消化6~8周雄性C57小鼠心脏组织,分离并鉴定心脏成纤维细胞;在不同干预时间、传代数、血清浓度培养条件下,采用qPCR、蛋白质印迹法和固定细胞免疫荧光技术检测ISO(10μmol/L)刺激后成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白荧光强度、mRNA、蛋白表达水平。分析不同干预时间、传代数、血清浓度培养条件下ISO刺激时心脏成纤维细胞的转分化特点。结果 (1)较长干预时间(48 h)ISO处理可使成纤维细胞转分化标志物α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白表达水平显著上调(P <0.05),而较短干预时间(24 h)ISO处理成纤维细胞转分化不显著(P> 0.05);(2)不同传代数心脏成纤维细胞对ISO刺激的反应不同,ISO刺激可以引起P1代和P2代心脏成纤维细胞转分化标志物表达水平显著上调(P<0.05),而培养到第3代和第4代,心脏成纤维细胞本身就已表现出了转分化;(3)血清浓度影响ISO引起的心脏成纤维细胞转分化,在0%和2%血清浓度下,ISO刺激引起转分化标志物表达水平上调(P <0.05),而在5%血清浓度下,ISO刺激心脏成纤维细胞与对照组相比转分化标志物表达水平差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 ISO刺激小鼠原代心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化时,在P1代和P2代用无血清或2%血清培养,ISO刺激48 h时,转分化标志物α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达最明显。