黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的构建糖类标记载体筛选克隆。方法以pPIC9K-βGl2为模板,通过PCR扩增得到全长的Bgl2基因片段,克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21(DE3),Cel-M9培养基筛选阳性克隆,经DNA测序分析,成功构建pET28a-Bgl2表达载体。SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。结果 PCR扩增得到Bgl2基因片段,SDS-PAGE显示蛋白以包涵体形式表达,克隆可用Cel-M9培养基筛选。结论用Cel-M9培养基筛选出阳性克隆为构建食品级载体奠定基础。

重组人胰高血糖素样肽-1类似物的制备及活性分析

通过重叠PCR的方法获得重组人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物PP-h[Gly8]GLP-1的目的基因片段,将该基因与融合表达载体pED连接,并在融合伴侣的N末端插入6×His标签,转入E.coli BL21(DE3),构建出重组GLP-1类似物融合表达菌。PP-h[Gly8]GLP-1通过Ni离子亲和色谱和酸水解等步骤分离纯化得到,其纯度大于90%,用电喷雾质谱法测定其相对分子质量与理论分析结果一致。ICR小鼠经口给予耐血糖及血浆胰岛素测定的结果表明,PP-h[Gly8]GLP-1具有明显的降血糖活性和促胰岛分泌作用(P<0.01),为开发潜在的治疗糖尿病药物提供了理论基础。

人胰高血糖素样肽-2类似物基因串联体构建及原核细胞表达

利用同尾酶法构建人胰高血糖素样肽-2类似物{PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)}基因串联体重组质粒,实现目的基因在大肠杆菌中高效表达。通过PCR扩增获得PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因片段,利用同尾酶BamHⅠ和BclⅠ产生相同的粘性末端,经连接、转化、筛选等操作构建其基因串联体。经DNA测序分析,成功构建PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)的二、四、六、八拷贝基因串联体。SDS-PAGE显示,各重组菌经D-乳糖诱导后均表达目的融合蛋白,其相对分子质量与预期结果相符,目的肽含量并非随串联个数增加而明显增加,改变融合伙伴后,目的肽的表达量从0.106 g/L提高到0.372 g/L,为大量制备和纯化PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)奠定了基础。

Exendin-4类似物的克隆、表达与体内生物活性检测

为研究Exendin-4类似物的克隆,融合表达及在体内的生物活性,在pED载体融合伴侣序列中插入利于下游分离纯化的序列成为5#载体,将Exendin-4类似物基因与5#载体中的融合伴侣基因通过酸水解位点连接,转化至E.coli BL21中并诱导表达融合蛋白,酸水解将目的肽与融合伴侣分开后,经阴离子交换树脂分离得到目的肽。6周～8周正常雄性ICR小鼠皮下注射Exendin-4类似物后,口服糖耐量实验检测在不同时间段小鼠血液中葡萄糖及胰岛素含量的变化。结果表明:融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,Exendin-4类似物纯度达91.8%。Exendin-4类似物的活性与对照组相比,具有显著的降低血糖和显著促进胰岛素分泌的活性(P<0.01)。

浅谈化学课堂教学中如何提高学生的学习兴趣

新课程标准要求化学教学要注重课堂教学实施,而课堂教学的有效实施要以学生的学习兴趣为前提。在化学课堂上,提高学生学习兴趣的方法有很多种,但如何在保证课堂教学有效性的前提下提高学生的学习兴趣,使我们的课堂活而不乱,值得我们每一位化学教师探讨。笔者从教学实际出发,对如何在保证课堂教学有效性的前提下提高学生学习兴趣,提出了一点看法。